铅是典型的中枢神经系统毒物。Kuhlman等观察了大鼠发育期在不同的铅暴露后Morris水迷宫中的表现，发现在怀孕和哺乳期的铅暴露可显著损害成年期大鼠的学习记忆能力^〔1〕。POU (Pit-Oct-Unc)域蛋白是一大类含POU结构域的转录因子家族，哺乳类动物POU域蛋白不仅在发育中的神经管表达，而且也出现在发育成熟的前脑和中脑^〔2〕，这些蛋白质对脑组织相应的神经细胞表型的确立起着重要作用。研究表明，POU家族中的Brn-3a转录因子是一种具有双重功能的蛋白质。它的POU结构域，除了调节它与DNA的结合，也能诱导那些蛋白产物很可能参与轴突生长的基因的表达，能促进神经生长进程。本实验采用免疫组织化学方法研究Brn-3a蛋白和神经丝蛋白(NF)的表达水平，了解铅暴露大鼠神经元中相关神经特异性蛋白的表达变化。

雌性SD大鼠20只，体重(250±15) g，雄性SD大鼠10只，体重(280±15) g (华中科技大学同济医学院实验动物中心)。

醋酸铅(河南焦作市化工三厂); 兔Brn-3a多克隆抗体(武汉博士德公司); 鼠神经丝蛋白(广谱)单克隆抗体(Neurofilament, NF)，即用型(抗兔)过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒(SP-Kit)，浓缩型二氨基联苯胺显色试剂盒(DAB-Kit)(北京中山生物技术有限公司); 其余试剂均为国产分析纯。

Lica冰冻切片机，CANON EDS 100-OLYMPUS BX 51数码显微照相系统(日本OLYMPUS公司); HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统(武汉千屏影像技术有限责任公司); 超低温水箱(中科美菱公司)。

SD大鼠在昼夜交换为12/12 h、温度为20 ℃左右的安静环境中，自由饮水进食。实验前适应性饲养3 d，第4 d雌雄1:2合笼交配，以发现阴栓并做阴道涂片发现精子当日为受孕第0 d，将20只受孕雌鼠随便机分4组; (1)对照组饮用蒸馏水; (2)低铅组饮用含0% 5 g/L醋酸铅水; (3)中铅组饮用含1.0 g/L醋酸铅水; (4)高铅组饮用含2 g/L醋酸铅水。每组5只，妊娠第15 d开始染毒，至仔鼠21 d断乳时为止。记录母鼠进食、饮水量、中毒死亡现象和体重变化; 以及仔鼠出生死胎率、出生体重和体重增长率。

随机取各组21日龄仔鼠5只，断头，迅速钳除颅骨，剥离硬脑膜及软脑膜，取出完整脑组织，置-80 ℃冰箱保存。在恒冷箱切片机内(-20 ℃制成14 μm冠状脑切片，于空气中晾干，置于冷丙酮中固定。

切片用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)洗涤; 加30% H₂O₂室温作用10 min，阻断内源性过氧化物酶; 加正常山羊血清室温封闭15 min; Brn-3a-抗或NF-抗(1:100稀释)，4 ℃湿盒内过夜; 然后按照即用型过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒说明书步骤进行。加新配制的3，3-二氨基苯联胺(DAB)显色，显微镜下控制染色5~10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)终止反应，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

免疫组化染色切片各脑区部位参照大鼠脑立体定位图谱对照观察。以正常山羊血清代替一抗作为替代对照，以0.01 mol/L PBS (pH 7.4)代替一抗作为空白对照。组织细胞显示棕色或棕色颗粒者为阳性，不显色为阴性反应。

选择适当部位显微照相，用HMIAS-2000图文分析系统，对免疫组化和原位杂交反应切片进行定量分析，所有切片放大倍数均为400倍。每组5只动物，每只动物Brn-3a染色各取2张切片，每张切片分别对大脑皮层、海马和小脑观察2个视野，视场面积74 156.8 μm×μm。分别测定阳性面积比[Aa (%)]和平均灰度，前者综合反应阳性面积和细胞数，后者反映着色深浅。

采用SPSS11.0软件进行分析，多组均数采用单因素方差分析进行F检验和q检验。

各组母鼠的一般状况及体重变化差异无统计学意义(P>0.05)，各组仔鼠的一般状况差异也无统计学意义(P>0.05)。经原子吸收测定，各剂量组仔鼠全血和脑组织铅含量显著高于对照组(P < 0.01)，并有良好的剂量效应关系(r值分别为0.967和0.839)。

表 1

表 1 铅对大鼠不同脑区Brn-3a蛋白表达的影响（x±s, n=20）

表 1 铅对大鼠不同脑区Brn-3a蛋白表达的影响（x±s, n=20）

除低铅组外，中高铅组阳性面积比减少，平均灰度升高，表明Brn-3a蛋白表达在数量及强度上均低于对照组，并呈剂量依赖关系。蛋白主要在核内表达，胞浆也有部分表达。

表 2

表 2 NF免疫反应阳性细胞的图像分析结果（x±s, n=20）

表 2 NF免疫反应阳性细胞的图像分析结果（x±s, n=20）

光镜下可见，NF免疫反应阳性细胞浆呈棕褐色。在大脑皮层、海马和小脑部位均有表达，主要在神经元核周，特别是在轴突有表达，呈细丝状，与对照组比，低铅组、中铅组NF阳性细胞基本无明显改变，而高铅组大脑皮层、海马和小脑NF阳性细胞数量减少，着色变浅，蛋白表达减少。

神经丝(NF)属于中间丝蛋白家庭的第Ⅳ类型，广泛存在于动物的成熟神经元中。在小鼠胚胎发育过程中，不同类型的NF按一定的时空表达模式出现，标志着神经元的成熟^〔3〕。NF是轴突直径的决定因素。

实验表明，铅在体外可导致培养海马神经元Brn-3a蛋白的表达下降^〔4〕。本研究体内动物模型也表明，铅染毒仔鼠的部分脑区的Brn-3a蛋白表达有不同程度的下降，与体外实验结果相吻合。如前所述，由于铅在神经细胞发育中具有重要功能影响神经元的正常分化。

本实验中发现，正常情况下发育后期大脑NF的量表现出较高的表达水平，这应是神经元分化成熟、轴突伸长的自然表现。但铅的处理使NF的含量下降，铅严重抑制了神经元轴突生长过程，这使大脑的结构和功能受到严重的破坏。在神经元的生长和分化过程中有多种基因表达产物是不可缺少的，其中编码神经丝基因的激活表达对于神经细胞出芽和突起生长延长是必需的^〔5〕，无论是对照组还是铅处理组大鼠的Brn-3a变化方式与NF相似，提示铅对转录因子Brn-3a的表达的抑制，从而导致神经丝的转录受到抑制，这可能是铅抑制神经细胞分化的主要原因之一，进一步证实了Brn-3a调控元轴突的生长过程，因此，推测铅对NF的影响可能是通过Brn-3a而实现的。