2009, Vol. 25
植物雌激素对人类有很多益处，如预防乳腺癌〔1〕、前列腺癌、结肠癌和子宫内膜癌〔2〕，改善绝经期症状等。但研究证明〔3-5〕，植物雌激素对动物生殖发育有不良作用，并且目前使用大豆异黄酮保健制品的人群也日趋增多。现已知此类保健品对更年期妇女能发挥雌激素样作用，但对正常成年人群是否有不良影响尚需进一步研究。本实验拟通过给予成年大鼠不同剂量的三羟异黄酮，观察大鼠生长发育的情况，评价膳食摄入三羟异黄酮对成年大鼠生长发育的影响。
1 材料与方法 1.1 材料纯度为98.2%的三羟异黄酮(陕西旭煌植物科技发展有限公司)。
1.2 主要仪器与试剂Biofuge Fresco低温高速离心机(日本Sorvall公司); UV-2350紫外分光光度计(日本岛津公司); 101-2AB高温烘烤箱(天津泰斯特仪器有限公司)。雌激素受体一抗、二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司); 发光液(美国Pierce公司); 雌二醇和睾酮放射免疫试剂盒(科美东雅生物技术有限公司)。
1.3 实验动物48只周龄SD大鼠(第四军医大学实验动物中心)，体重为130~150g，雌雄各半。
1.4 动物分组及处理适应性喂养3d后将大鼠随机分为3组，每组16只，雌雄各8只，每天给予各组大鼠含相应剂量三羟异黄酮的基础饲料喂养至其13周龄。对照组0 mg/kg，中剂量组20 mg/kg，高剂量组100 mg/kg。
1.5 饲料配方基础饲料为大鼠常备饲料配方〔6〕。对照组，中、高剂量组分别将0，20，100 mg/kg的三羟异黄酮粉末混入基础饲料粉末中，混匀后加水制成棒状，置入烤箱80 ℃烘烤8 h制成处理组饲料。
1.6 雌二醇和睾酮测定大鼠成长至13周龄时断头法处死各组大鼠并取血，以400 r/min离心10 min，分离血清，用放射性免疫测定法〔7〕测定雌鼠血清雌二醇水平和雄鼠血清睾酮水平。
1.7 子宫、卵巢雌激素受体(ER)蛋白表达的测定用蛋白印迹(western blotting)方法〔8〕测定雌鼠子宫ER蛋白表达水平。雌激素受体(ER)一抗稀释比例1:500，二抗稀释比例1:1000，发光法成像，采用美国Quantity One分析系统分析。
1.8 统计分析应用SPSS 11.0软件进行分析。多组间比较用单因素方差分析，对照组和处理组间比较用Dunnett-t检查，ER表达下降率采用多样本χ2检验。
2 结果 2.1 各组大鼠体重变化情况(表 1)
|
表 1 不同周龄各组大鼠体重比较(kg, x±s) |
9~10周龄时中、高剂量组雌、雄鼠与对照组比较，差异均无统计学意义。至11~13周龄时中、高剂量组雌鼠体重均低于对照组，差异均有统计学意义(P < 0.05);雄鼠在此期间体重与对照组比较，差异均无统计学意义。
2.2 摄食量(表 2)|
|
表 2 不同周龄各组大鼠摄食量比较(g, x±s) |
中、高剂量组雌鼠11周龄开始摄食量逐渐下降，与对照组比较，差异均有统计学意义(P < 0.05);高剂量组雄鼠10~13周龄时摄食量高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。
2.3 组织重量13周龄时，中、高剂量组及对照组雌鼠的卵巢重量分别为(0.12±0.03)，(0.12±0.01)，(0.14±0.02) g; 双侧子宫重量分别为(0.51±0.18)，(0.47±0.13)，(0.57±0.11) g; 中、高剂量组雌鼠卵巢及双侧子宫重量与对照组比较，差异均无统计学意义。中、高剂量组及对照组雄鼠的双侧睾丸重量分别为(3.12±0.25)，(3.04±0.31)，(3.08±0.30) g，中、高剂量组雄鼠睾丸重量与对照组比较，差异均无统计学意义。
2.4 激素水平13周龄时，雌鼠中、高剂量组血浆雌二醇水平分别为(23.50±4.01)，(25.20±6.28) pmol/L，与对照组的(29.17±5.44) pmol/L比较，差异均无统计学意义。中、高剂量组雄鼠睾酮水平分别为(44.70±9.03)，(40.86±9.30) ng/mL，与对照(36.45±4.69) ng/mL比较，差异均无统计学意义。
2.5 子宫、卵巢ER蛋白表达13周龄时，中、高剂量组雌鼠子宫ER-α表达量分别为对照组的43.13%和38.78%。
3 讨论给予成年大鼠三羟异黄酮4周后，发现高剂量组雌鼠摄食量和体重均有所下降，与Michael RM〔9〕的试验结果一致。表明本实验中三羟异黄酮发挥了抗雌激素样作用，表现为受试动物摄食量和体重下降，抑制生长发育等。植物雌激素的结构与雌激素相似，它能够与体内的雌激素受体结合，发挥雌激素样或抗雌激素样作用，这取决于其暴露剂量等因素。另外，实验中各剂量组雌鼠子宫ERα受体表达量均下降。三羟异黄酮可作用于ERα和β，其中ERα富含于子宫，其异常表达能够引起子宫病变，如子宫内膜异位症。龙晓宇等对子宫内膜异位症患者的异位内膜间质细胞中的ERα和β含量测定发现，其表达量均低于对照组〔10〕。提示三羟异黄酮对成年雌鼠的子宫产生不良影响，可能与目前食用三羟异黄酮治疗绝经症状的妇女其子宫内膜癌患病率升高有关。而摄入三羟异黄酮对正常成年雄鼠的作用不明显，但若加大剂量则有可能对其生殖系统产生影响，有待进一步研究。
| [1] | 李晶, 李忠, 莫宝庆. 三羟异黄酮对人乳腺癌细胞外调节激酶影响[J]. 中国公共卫生, 2006, 22(5) : 546–547. |
| [2] | Adlercreutz H. Phyto-estrogens and cancer[J]. Lancet Oncol, 2002, 3 : 364–373. DOI:10.1016/S1470-2045(02)00777-5 |
| [3] | Jefferson WN, Elizabeth PB, Newbold RR. Disruption of the female reproductive system by the phytoestrogen genistein[J]. Reproductive Toxicology, 2007, 23 : 308–316. DOI:10.1016/j.reprotox.2006.11.012 |
| [4] | Lee YM, Choi JS, Kim MH, et al. Effects of dietary genistein on hepatic lipid metabolism and mitochondrial function in mice fed high-fat diets[J]. Nutrition, 2006, 22 : 956–964. DOI:10.1016/j.nut.2005.12.014 |
| [5] | Becker LA, Kunkel AJ, Brown MR, et al. Effects of dietary phytoestrogen exposure during perinatal period[J]. Neurotoxicology and Teratology, 2005, 27 : 825–834. DOI:10.1016/j.ntt.2005.05.007 |
| [6] | 李丽, 张晓鹏, 张文众, 等. 哺乳期母鼠暴露大豆异黄酮对仔鼠卵巢类固醇受体表达的影响[J]. 卫生研究, 2007, 36(5) : 564–567. |
| [7] | Ryökkynen A, Kukkonen JV, Nieminen P. Effects of dietary genistein on mouse reproduction, postnatal development and weight-regulation[J]. Animal Reproduction Science, 2006, 93 : 337–348. DOI:10.1016/j.anireprosci.2005.08.007 |
| [8] | Thasni KA, Rojini G, Rakesh SN, et al. Genistein induces apoptosis in ovarian cancer cells via different molecular pathways depending on breast cancer susceptibility gene-1(BRCA1) status[J]. European Journal of Pharmacology, 2008, 588 : 158–164. DOI:10.1016/j.ejphar.2008.04.041 |
| [9] | Mcclain RM, Wolz E, Davidovich A, et al. Acute, subchronic and chronic safety studies with genistein in rats[J]. Food and Chemical Toxicology, 2006, 44 : 56–80. DOI:10.1016/j.fct.2005.05.021 |
| [10] | 龙晓宇, 关咏梅. 子宫内膜异位症患者异位内膜间质细胞雌激素受体-α、雌激素受体-β的表达[J]. 实用医学杂志, 2008, 24(18) : 3126–3128. |