中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (6): 676-678   PDF    
引用本文
吴健, 穆瑞瑞, 任存邦, 王春阳, 李珏, 张卫东, 范清堂, 段广才. 志贺菌耐多药外排泵emrE基因作用分析[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(6): 676-678.
WU Jian, MU Rui-rui, REN Cun-bang, et al. Effect of genetically modified efflux pump emrE in isolated Shigella spp.[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(6): 676-678.
志贺菌耐多药外排泵emrE基因作用分析
吴健1,2, 穆瑞瑞2, 任存邦2, 王春阳2, 李珏2, 张卫东1, 范清堂1, 段广才1     
1. 郑州大学公共卫生学院, 郑州450001;
2. 郑州大学生物工程系
收稿日期: 2008-10-20
基金项目: 河南省科技攻关项目资助课题(0424410035)
作者简介: 吴健(1961-), 男, 江苏宜兴人, 教授, 博士在读, 研究方向:耐药机制与代谢工程。
通讯作者: 段广才
摘要: 目的 对临床耐多药志贺菌株H24的1种小多重耐药性家族(SMR)外排泵emrE基因进行定向分子进化, 研究基因突变增强emrE外排泵耐药性的潜力, 调查志贺菌外排泵基因emrE基因垂直进化对临床耐药发展的影响。 方法 通过用体外易错PCR (EP-PCR)方法对emrE基因进行随机突变实验, 用微量稀释生长曲线法进行菌株的耐药性筛选, 用荧光实时定量RT-PCR测定基因表达情况, 应用DNA分析软件DNAStar进行生物信息学分析。 结果 在31个突变子中筛选到了突变子ep2-emrE(DH5α), 它的emrE基因有6个氨基酸突变, 分别为Thr-28→Ala, Cys-39→Ser, Tyr-40→终止子, Ser-72→Arg, Leu-93→Phe, Ile-101→Phe。它不但增强四环素和红霉素的耐药能力, 还产生新的氯霉素耐药能力。 结论 尽管emrE基因较易获得新增耐药性, 但在志贺菌对四环素、红霉素等抗生素耐药性发展中, emrE基因的进化突变没有被筛选, 表明有其他能力更强的耐药基因在突变进化中起作用。
关键词： 志贺菌     耐药性     emrE基因     分子进化    
Effect of genetically modified efflux pump emrE in isolated Shigella spp.
WU Jian, MU Rui-rui, REN Cun-bang, et al     
College of Public Health, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China
Abstract: Objective To study the potential gene mutation increasing the drug resistance ability of emrE efflux pumpvia genetic modification of the emrE gene from clinical isolated Shigella spp.stra in H24, and to investigate the relationship between clinical drugresistance development of Shigella spp.and the vertical evolution of emrE efflux pump. Methods Gene emrE was mutated viaerror prone PCR.Drugres is tance of the strain was determined by microdilution growth curve method.The expression of the genes was measured by fluorescent quantitative RT-PCR and the bioinformatics analysis was conducted by DNAS tar. Results Among the 31 mutants, ep2-emrE showed the ability of increasing tetracyc line and ery thromyc in res is tance and the newly gained ability of chlorom ycetinres is tance indicating the mutational potent of the gene. Conclusion Although it is easy for gene emrE to achieve new drug resistant ability, the mutation and vertical evolution of the emrE gene is not selected in the development of tetracyc line and eryth romyc in resistance.So, there may be some more strong multid rug resis tance genes and mutation.
Key words: Shigella spp.     drug resistance     emrE gene     molecular evolution    
1 材料与方法 1.1 材料

(1)菌株：大肠埃希菌DH5α，临床分离志贺菌耐多药株H24(郑州大学公共卫生学院流行病教研室收集保存); (2)载体：pMD18-T载体(宝生物大连有限公司); (3)工具酶及试剂：SacⅠ内切酶、BamHⅠ内切酶、胰RNA酶、DNA回收试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM荧光扩增体系(宝生物大连有限公司); 抗生素(中国药品生物制品检定所); 酵母提取物和蛋白胨(英国Oxiod公司)。营养肉汤水解酪蛋白培养基(MH)(北京奥博星公司)。

1.2 方法 1.2.1 志贺菌H24基因组DNA提取

按文献〔4〕方法进行。

1.2.2 志贺菌临床耐多药株H24外排泵emrE基因片段扩增

按文献〔5〕方法进行。

1.2.3 易错聚合酶链式反应(Error prone PCR, EP-PCR)

EP-PCR使用的引物与扩增H24外排泵emrE基因使用的引物相同〔5〕, 以用H24为模板扩增的emrE基因为模板。采用MgCl2 25 mmol/L，MnCl2 5 mmol/L EP-PCR反应体系, EP-PCR产物用DNA快速回收试剂盒回收。

1.2.4 序列测定

纯化后的易错emrE基因与pMD18-T载体于16 ℃连接过夜, 连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞中。利用蓝白斑法筛选重组克隆; 碱裂解法从菌液中提取质粒，用SacⅠ单酶切及SacⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定emrE阳性质粒。验证均为阳性的质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.5 微量稀释生长曲线法测定菌株耐药性

采用MH液体培养基, 在无菌操作下将倍比稀释后不同浓度的抗生素溶液利福霉素、红霉素、硫酸新霉素、盐酸四环素、氯霉素、环丙沙星和盐酸强力霉素分别加到灭菌的96孔板中，每孔10 μl，只加培养基作为阴性对照。0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经MH肉汤1:1000稀释后，向每孔中加100 μl，每个处理3个并行重复。置于37 ℃培养箱中震荡培养，4 h后在酶标仪450 nm处测定菌体浓度吸光度(A)值，以后每隔3 h测1次A值, 结果取平均值。为防止染色体突变造成的假阳性结果，所有重组菌株在测得耐药性变化后，再提取质粒重新转化新的大肠埃希菌DH5ɑ菌株。如果再次测得同样的耐药性，则确认耐药是由质粒携带的外源突变基因引起的。

1.2.6 荧光实时定量RT-PCR

利用Primer 5.0设计引物，以大肠埃希菌内稳定表达的看家基因gapA基因的380 bp片段作为内参，emrE基因内部的190 bp序列为目的序列，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。目的基因引物为GGGTTTACACGGTTATGGC和GGGTTTACACGGTTATGGC，看家基因的引物为CTGGTCCGTCTAAAGACAACA和ACGAACGGTCAGGTCAACTA。分别以对照株pMD (DH5α)和pMD-emrE(DH5α)及emrE基因突变重组株cDNA为模板，同时扩增emrE基因片段及甘油醛3-磷酸脱氢酶gapA基因片段。荧光实时定量PCR采用Rotor-Gene 3000荧光实时定量PCR仪(澳大利亚Corbett Research公司); 采用SYBR Premix Ex TaqTM荧光扩增体系，进行40个循环并于60 ℃记录荧光强度，然后测定熔解曲线。每个样品重复做3管。通过Rotor-Gene 3000分析软件，得到目的基因和看家基因的循环域值(Ct值)和熔解曲线，采用相对定量的Comparative Delta-delta Ct方法，得到目的基因相对的拷贝数。

1.3 生物信息学分析

肽链序列比对分析由DNASTAR Inc.的DNAStar Lasergene软件处理。

2 结果 2.1 EP-PCR扩增(图 1)

经过条件摸索和优化，2次EP-PCR (epA, epB)扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，均在约1100 bp处有一特异扩增条带，分子量大小与预期扩增值相符。将EP-PCR扩增产物与pMD-18T载体连接，并转入DH5ɑ菌株进行筛选，共得到31株重组株。提取质粒酶切电泳检测后，送样测序。

注：M:DL2000 Marker; 1, 2：epA-emrE; 3：epB-emrE。 图 1 EP-PCR扩增产物凝胶电泳分析

2.2 菌株的耐药性变化(图 2)
图 2 pMD-epl-emrE(DH5ɑ)和pMD-ep2-emrE(DH5ɑ)耐药性变化

选用不同EP-PCR变异株pMD-ep1-emrE(DH5ɑ)和pMD-ep2-emrE(DH5ɑ)，通过微量稀释生长曲线法测定这2株进化菌株及出发基因对照株pMD-emrE(DH5ɑ)和空质粒对照株pMD (DH5α)对利福霉素、红霉素、硫酸新霉素、四环素、氯霉素、环丙沙星和强力霉素的耐药性。从生长曲线可以看出，pMD-ep2-emrE(DH5ɑ)菌株对四环素、红霉素和氯霉素的抗性比含原始基因株pMD-emrE(DH5ɑ)增高，其中氯霉素为新获得的耐药性, 表明经进化突变的ep2-emrE基因外排活性增强。

2.3 重组菌株中EP-PCR emrE基因表达

为近一步确认突变基因的表达情况，对重组菌中emrE基因的表达进行实时荧光定量反转录分析。在溶解曲线中未检测到引物二聚体和其他非特异性荧光信号。荧光实时定量RT-PCR获得pMD (DH5a)、pMD-emrE(DH5ɑ)、pMD-ep1-emrE(DH5ɑ)、pMD-ep2-emrE(DH5ɑ)4个样本的平均Ct值和mRNA相对表达量。其emrE基因的相对表达量分别为1，20300，23600和49000倍。ep2-emrE基因不但得到表达，而且它的mRNA表达量最高。

2.4 ep1-emrE、ep2-emrE的序列分析和氨基酸序列同源性比对

对原始emrE和突变基因ep1-emrE、ep2-emrE的DNA测序结果用DNASTAR 7.1.0软件对3个基因序列进行比对。结果显示, 在开放阅读框内ep1-emrE有5个点突变，ep2-emrE有9个点突变。经氨基酸同源性比较，ep1-emrE有5个氨基酸突变，分别是Glu-14→Gly, Met-21→Ile, Ile-54→Met, Ile-71→Asn, Trp-76→Arg; ep2-emrE有6个氨基酸突变, 分别是Thr-28→Ala，Cys-39→Ser，Tyr-40→终止子，Ser-72→Arg，Leu-93→Phe，Ile-101→Phe。ep2-emrE虽然Tyr-40突变成了UAA终止子，但从pMD-ep2-emrE(DH5ɑ)的耐药表现看，肽链合成并没有被完全中止，UAA终止子可能被无义抑制子(nonsense suppressor)所抑制〔6〕。

3 讨论

本研究结果表明，在31个突变子中筛选出的突变子ep2-emrE，不但有增强的四环素和红霉素耐药能力，还有新产生的氯霉素耐药能力, 显示这种外排泵基因具有突变增强耐药性的潜力。根据本研究前期结果〔5〕分析，本研究结果尚不能表明这种外排泵基因在临床志贺菌对四环素、红霉素等的耐药性的发展中起着重要作用。原因为：(1)通过对emrE基因的系统发育分析表明，它有很强的进化规律和保守性，在不同种属中有很强的归属性，与个体耐药性无关; (2)本实验所用志贺菌H24是2002年在江西省铜鼓县分离得到的临床耐药株，其emrE基因与20世纪50年代在北京分离的宋氏志贺菌Ss046基因序列竟然完全一致〔5〕，说明50年来志贺菌红霉素和四环素耐药性的迅速发展与emrE基因突变没有关系。

实验结果表明，在细菌中有一个强大的耐药基因武器库，新的药物环境会进化筛选出新的改进型耐药基因。在志贺菌H24中，可能还有更强的红霉素、四环素耐药基因和耐药突变在起作用。因此，象emrE基因这样耐药能力较弱基因的突变在临床上未被筛选。在志贺菌中起作用的红霉素、四环素耐药基因还待进一步研究。

参考文献
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