甲苯二异氰酸酯(toluene diisocyanate, TDI)是合成聚氨酯的主要原料，工业上广泛用于氨基甲酸泡沫胶、合成橡胶、油漆、涂料、塑料等的生产。长期接触和使用，可对人体的呼吸系统、免疫系统、生殖系统等造成损害。已有研究证实，TDI对动物有致癌作用，为人类的可疑致癌物^〔1〕。国际癌症研究机构(IARC)体外实验显示，TDI可引起人淋巴细胞DNA损伤和染色体畸变，啮齿动物细胞基因突变和姐妹染色单体交换^〔2〕。DNA损伤是导致基因突变发生的一个必不可少的前提。DNA交联作为一种重要的DNA损伤，在细胞内大量存在可以干扰细胞正常的复制转录过程，从而导致肿瘤或某些严重疾病的发生^〔3〕。本研究以中国仓鼠肺细胞(CHL)为靶细胞，探讨甲苯二异氰酸酯(TDI)对细胞内DNA的交联作用，揭示其遗传毒性，为评价TDI类化合物潜在的生物学效应提供科学依据。

MC-20AIC型CO₂恒温培养箱(日本SANYO公司); SW-CJ-2F型生物洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司); 荧光分光光度计RF-540(日本岛津Shimazu公司)。PRMI-640培养基(美国Gibco公司); 小牛血清(上海纬群生物技术有限公司); 乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白酶K、Hoechst 33258、小牛胸腺DNA (美国Sigma公司); 其他试剂如氯化钾(KCl)、二甲基亚砜(DMSO)等均为国产分析纯。甲苯二异氰酸酯(TDI，分析纯，美国Sigma公司); 中国仓鼠肺细胞(CHL，中国协和医科大学基础所细胞室)。

将处于对数生长期的CHL细胞(10⁵~10⁶)接种于培养瓶中，培养24 h后，加入不同浓度的TDI，终浓度分别为0.64，1.28，2.56 μmol/mL，同时设溶剂对照组(DMSO)和紫外线照射阳性对照组; 继续培养2 h，消化离心收集细胞。

在制备好的细胞悬液中加入0.5 mL SDS (2%)溶液，轻微振荡，65 ℃水浴中加热10 min，待用。

在上述待测样品中加入100 μl的1.0 mol/L的KCl (pH 7.5)，将混合液6次穿过1 mL的聚丙烯枪头，冰上冷冻5 min后，SDSK⁺沉淀(包括蛋白质和DPC形成，4 ℃ 10 000 r/min离心5 min，收集沉淀，将上清(DNA、DDC)转入另一5 mL离心管中。

将上述沉淀重悬浮于0.5 mL的清洗缓冲液(KCl 0.1 μmol/L，EDTA 0.1 mmol/L, Tris-HCl 20 mmol/L，pH 7.5)中，加入0.5 mL的蛋白酶(0.4 mg/mL)，50 ℃水浴消化3 h，冰上骤冷5 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，收集上清液，将上清液转入上述5 mL离心管中。再向沉淀中加入1 mL的清洗缓冲液重悬，65 ℃水浴中加热10 min，冰上骤冷5 min，4 ℃ 10 000 r/min离心5 min，收集沉淀，重复清洗步骤3次，每次都将上清转入上述5 mL离心管中。

将上述5 mL离心管中的上清液混匀后，各取1 mL分装2管作为待测样品，一管在100℃水浴中加热5 min进行热变性，随后快速冷却至23 ℃，使其中游离的DNA变性后不致复性。

向上述待测样品中加入1 mL新鲜配制的400 ng/mL的荧光染料Hoechst33258, 使终浓度为200 ng/mL，置于暗处30 min，用荧光分光光计在353 nm激发光和455 nm发射光下测得其荧光值，按下式计算DNA-DNA交联率。

DNA-DNA交联率：Ct=(fn-f0)/(1-f0)。式中Ct为DNA-DNA交联率，fn为染毒组中热变性后的荧光强度/热变性前的荧光强度，f0为对照组中热变性后的荧光强度/热变性前的荧光强度。

在染毒后的细胞沉淀中分别加入0.5 mL SDS (2%)溶液，轻微振荡，65℃水浴中加热10 min，裂解细胞。

从水浴取出裂解好的细胞，加入1.0 mol/L KCl (pH 7.5)溶于20 mmol/L Tris-HCl中100 μl，将混合液6次穿过1 mL的聚丙烯枪头，从而使DNA长度统一。混合液冰上冷冻5 min，形成SDS-K⁺沉淀，4 ℃ 10 000 r/min离心5 min，收集沉淀，将上清液转入另一5 mL离心管中。沉淀加1 mL清洗缓冲液重悬，65 ℃水浴加热10 min，冰上骤冷5 min，重复离心和清洗步骤3次，每次都将上清液转入5 mL离心管中。

最终的沉淀重悬于0.5 mL的清洗缓冲液中，然后加入0.5 mL的蛋白酶K (0.4 mg/mL)，50 ℃水浴中消化3 h，再在冰上骤冷5 min，然后于4 ℃12 000 r/min离心10 min，收集上清液即为DPC中的DNA。

制作DNA浓度的标准曲线，用清洗缓冲液配制终浓度为0，100，300，500，750，1 000，1 500，2 000，3 000，5 000 ng/mL的小牛胸腺DNA标准液，然后加入1 mL新鲜配制的400 ng/mL荧光染料Hoechst33258，使荧光染料的终浓度为200 ng/mL，置于暗处染色30 min，用荧光分光光度计在350 nm激发光和450 nm发射光下测得各浓度的荧光值，制备标准曲线。将上述待测样品用同样方法染色，测定其荧光值，根据DNA标准曲线来定量DPC中DNA (A)和原液中DNA (B)的含量，按下式计算DPC系数：η=A/A+B×100%。

应用SPSS 13.0软件进行分析。

图 1

注：与对照组比较，a p < 0.05，b p < 0.01。 图 1 TDI诱导cHL细胞DDC效应

随着TDI浓度增高，染毒组细胞DNA-DNA交联率增加。0.64 μmol/LmL TDI染毒组，CHL细胞DNA-DNA交联率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);当浓度上升至1.28 μmol/mL时，DNA-DNA交联率明显上升，与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05);浓度升高至2.56 μmol/mL时，DNA-DNA交联率为54.79%，与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01)，表明TDI在低浓度时不能引起DNA-DNA交联，在较高浓度时，能够明显地诱导DDC的形成，并且浓度与DNA-DNA交联率之间存在剂量-效应关系。

图 2

注：与对照组比较，a p < 0.01。 图 2 TDI诱导CHL细胞DPC效应

图 2显示，经0.64 μmol/mL TDI染毒处理的CHL细胞，DPC系数与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);但是，当浓度上升至1.28和2.56 μmol/mL时，DPC系数明显上升，且与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01)。表明TDI在低浓度时，不会引起DNA-A蛋白质交联; 在较高浓度时，能够明显地诱导DPC的生成。

DNA交联包括DNA-DNA交联(DDC)和DNA-蛋白质交联(DPC)2种，是外来化学物作用于DNA所致的重要遗传损伤形式。与其他类型DNA损伤相比，DNA交联较难修复或易于发生易错修复，在细胞周期中维持时间较长，导致染色体断裂、缺失，基因突变和细胞的死亡^〔6〕。

本研究结果表明，低浓度的TDI (0.64 μmol/L)不能致DNA-DNA交联(DDC)率和DNA-蛋白质交联(DPC)率发生明显变化(P>0.05);随着染毒浓度的增加(1.28，2.56 μmol/mL)，其DDC交联率和DPC交联率也随之升高，可导致明显的DDC效应(P < 0.01)和DPC效应(P < 0.01)。提示一定剂量的TDI能诱导细胞内DNA交联。Peel M等研究发现，经TDI处理的DNA形状与对照不同，且复性后14%DNA发生重构^〔7〕，与本实验结果相似。

随着人们生活水平的提高，各种涂料已成为美化环境不可缺少的装饰材料，大量聚氨酯油漆、防水涂料、聚氨酯密封的使用，使TDI成为室内主要空气污染物之一。因此，应加强环境空气监测和作业人群健康监护，降低和限制各种装饰材料中游离TDI含量，避免长期接触对机体健康造成危害。