中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (6): 665-666   PDF    
引用本文
曹军, 姜丽平, 耿成燕, 姚晓, 仲来福. 姜黄素致人结肠癌HT-29细胞DNA损伤作用[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(6): 665-666.
CAO Jun, JIANG Li-ping, GENG Cheng-yan, et al. Comparison of curcumin-induced damage of mitochondrial DNA and nuclear DNA by long PCR[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(6): 665-666.
姜黄素致人结肠癌HT-29细胞DNA损伤作用
曹军, 姜丽平, 耿成燕, 姚晓, 仲来福     
大连医科大学卫生学教研室, 大连 116044
收稿日期: 2008-10-15
基金项目: 国家自然科学基金(30771820)
作者简介: 曹军(1968-), 女, 辽宁抚顺人, 副教授, 博士, 主要从事生化与分子毒理学研究。
通讯作者: 仲来福
摘要: 目的 探讨姜黄素致人结肠癌HT-29细胞线粒体DNA (mtDNA)和核DNA (nDNA)损伤作用。 方法 人结肠癌HT-29细胞暴露于不同质量浓度的姜黄素(0.0, 2.5, 5.0, 10.020.0μg/ml)2h后, 采用长链PCR方法分别扩增mtDNA和nDNA片段, 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物量。 结果 mtDNA扩增产物在5.0μg/ml姜黄素作用下明显下降, 在5.0, 10.020.0μg/ml作用下mtDNA损伤频率分别为(1.23±0.10), (1.97±0.24)和(5.78±0.62)/10kb, 与对照组比较, 差异均有统计学意义(P < 0.01);nDNA扩增产物在20.0μg/ml姜黄素作用下才明显下降, 在5.0, 10.0, 20.0μg/ml作用下nDNA损伤频率分别为(0.27±0.04), (0.61±0.11)和(1.61±0.12)/10kb, 与对照组比较, 除5.0μg/ml作用组外差异均有统计学意义(P < 0.01)。 结论 姜黄素对HT-29细胞的mtDNA和nDNA损伤均呈剂量依赖关系, 并且对mtDNA的损伤作用明显大于nDNA。
关键词： 姜黄素     线粒体DNA (mtDNA)     DNA损伤     人结肠癌    
Comparison of curcumin-induced damage of mitochondrial DNA and nuclear DNA by long PCR
CAO Jun, JIANG Li-ping, GENG Cheng-yan, et al     
Laboratory of Toxicology, Dalian Medical University, Dalian 116044, China
Abstract: Objective To compare the damage effects of crown in on mitochondrialDNA (mtDNA) and nuclea DNA (nDNA) in human colon cancer cell line HT-29. Methods After HT-29 cells were exposed to various concentrations of cureum in (0, 2.5, 5.0, 10.0, 20.0μg/ml) for 2h, high molecular weight DNA was isolated and long polymerase chain reaction (LPCR) assay was perfouned to deteun ine the damage of mtDNA and nDNA. Results A 2h exposure of HT-29 cells to cureum in led to a dose-dependent decrease in the amplification of both mtDNA and nDNA.Loss of amplification of the mtDNA occurred at a lower dose of curcum in (5μg/ml) compared with the nDNA (10μg/ml).For mtDNA, DNA lesion frequencies for groups with different concentrations of cureum in (5, 10 and 201μ/ml) were 1.23±0.10, 1.97±0.24 and 5.78±0.62 lesions/10kb (P < 0.01), and that of for nDNA were 0.27±0.04, 0.61±0.11 and 1.61±0.12 lesions/10kb, respectively. Conclusion In HT-29 cells, curcum in induces DNA dam age to both m1DNA and nDNA, and the damage to mtDNA is more serious as compared with nDNA.
Key words: curcumin     mitochondrial DNA     nuclear DNA     damage    

姜黄素(curcumin)是从草本植物姜黄的根茎中提取的酚类色素，是姜黄的主要活性成分，在亚洲被广泛应用于调味剂、食品色素及治疗炎症的中草药中。其主要药理作用有抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗脂质过氧化、抗病毒等〔1, 2〕。美国国立肿瘤所已将其列为第3代抗癌化学预防药，成为肿瘤预防和治疗的研究热点。本研究采用人结肠癌HT-29细胞作为体外模型，通过长链PCR方法，观察姜黄素对癌细胞线粒体DNA (mtDNA)和核DNA (nDNA)的损伤作用，并对两者的损伤程度进行比较分析。

1 材料与方法 1.1 主要试剂及药品

姜黄素(纯度≥95.6%，西安崇信天然添加剂公司); Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)培养基、F12培养基、胎牛血清(美国GIBCO公司); 二甲基亚砜(美国Sigma公司); Qiagen AmPrep (QIAamp)小量DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司) RT-PCR试剂盒(RNA PCR Kit Ver. 3.0)、长链PCR扩增试剂盒(LA PCR Kit Ver.2.1)(日本TaKaRa公司)。其他试剂均为分析纯。

1.2 细胞培养

人结肠癌HT-29细胞(中国协和医科大学); 培养基为含双抗(100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素)及10%胎牛血清的DMEM和F-12(1:1比例)培养液，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养〔3〕。取处于指数生长期的细胞用于实验。

1.3 长链PCR (LPCR)检测姜黄素对mtDNA和nDNA的损伤

HT-29细胞(1×106)接种24 h后，用不同质量浓度的姜黄素(0.0，2.5，5.0，10.0，20.0 μg/ml)37 ℃处理2 h，胰酶消化收集细胞，用QIAamp小量DNA提取试剂盒提取总DNA，其中质量浓度为0.0 μg/ml的姜黄素作用组作为对照组。测定方法见文献〔4〕，按长链PCR试剂盒说明操作。50 μg反应体系中含有2 μl模板DNA，5 μl 10×LA PCRTM缓冲液(Mg2+ plus)，8 μl脱氧核苷三磷酸(dNTP)，上、下游引物各1 μl，0.5 μl TaqTM。引物序列如下：线粒体基因组片段(16.2 kb)，5′-TGAGGCCAAATATCATTCTGAGGGGC-3′和5′-TTTCATCATGCGGAGATGTTGGATGG-3′; 核基因组DNA β-globin上游片段(17.5 kb)，5′-ACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACTCAGA-3′和5′-TGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTC-3′。PCR反应按如下进行：94 ℃热变性1 min，98 ℃热变性20 s，68 ℃延伸15 min的程序反应35个循环，72 ℃延伸10 min。含溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶检测PCR产物，用Bioimaging systems (labworks TM ver 4.6，美国UVP公司)扫描分析。DNA损伤频率按如下公式计算：λ=-lnAD/AO，AO为未损伤模板DNA扩增产物的扫描条带强度，AD为损伤模板DNA扩增产物的扫描条带强度。

1.4 统计分析

采用SPSS 11.5软件进行分析，组间比较采用t检验。

2 结果 2.1 mtDNA和nDNA扩增产物量(图 1)
图 1 mtDNA和nDNA基因组片段扩增产物

mtDNA和nDNA的扩增产物量均随姜黄素质量浓度的增大而减少，呈剂量依赖关系。扫描结果显示，mtDNA扩增产物量在5.0 μg/ml姜黄素作用下有明显下降，而nDNA在20.0 μg/ml姜黄素作用才明显下降。

2.2 mtDNA和nDNA的损伤频率(图 2)
注:与对照组比较, *P < 0.01。 图 2 mtDNA和nDNA的损伤频率

与对照组比较，mtDNA的扩增产物量在5.0 μg/ml姜苏素作用下，差异有统计学意义(P < 0.01);而nDNA在10.0 μg/ml姜黄素作用下，差异有统计学意义(P < 0.01)。分别在5.0，10.0，20.0 μg/ml姜黄素作用下，mtDNA和nDNA的扩增产物量比较，差异均有统计学意义(P < 0.01)。在5.0，10.0，20.0 μg/ml作用下，mtDNA损伤频率分别为(1.23±0.10)，(1.97±0.24)和(5.78±0.62)/ kb，与对照组比较，差异均有统计学意义(P < 0.01)。nDNA损伤频率分别为(0.27±0.04)，(0.61±0.11)和(1.61±0.12)/10 kb，与对照组比较，除5.0 μg/ml姜黄素作用外，差异均有统计学意义(P < 0.01)。

3 讨论

研究表明，姜黄素能造成体外细胞，如人胃黏膜细胞、人外周血淋巴细胞等的DNA损伤〔5, 6〕。对于哺乳动物nDNA不是唯一的遗传物质，在核外还存在着线粒体基因组，并且mtDNA编码氧化磷酸化的重要组件，为细胞的各项功能提供能量。因此，mtDNA的损伤比nDNA的损伤对细胞的功能造成的负作用可能更强。研究已发现，线粒体在细胞凋亡中起着重要作用，而mtDNA的损伤可造成线粒体功能的缺失，进一步诱导细胞凋亡〔7〕。本研究采用LPCR法同时扩增mtDNA和nDNA发现，姜黄素对mtDNA和nDNA均可造成损伤，并且对mtDNA的损伤程度明显大于nDNA。mtDNA对损伤更敏感的主要原因在于：(1)缺乏组蛋白或DNA连接蛋白; (2)缺乏修复机制; (3)只含有外显子而无内含子; (4)复制速度快而缺乏纠错能力〔8〕。同时，线粒体是活性氧(ROS)产生的主要场所，因此，与nDNA相比，mtDNA与ROS接触密切，容易受到攻击而发生氧化性损伤〔9〕。本研究结果提示，mtDNA的损伤可能是姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡或死亡过程等一系列生物学作用的主要原因之一，此推论有待进一步研究证实。

参考文献
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