2009, Vol. 25
, 陈晓栋, 匡刚, 牛强, 郭丽娟, 黄南, 陈学敏 2, 2', 4, 4'-四溴联苯醚(PBDE-47)是存在于环境样本和人体组织中最主要的多溴联苯醚(PBDEs)同系物之一, 其毒性强, 分布广, 与人类健康关系密切〔1〕。非共平面结构的2, 2', 4, 4'5, 5'-六氯联苯(PCB153)是人体组织中含量最多的多氯联苯(PCBs)同系物之一〔2〕。由于PBDEs与PCBs结构类似, 具有相似的毒性作用, 在环境与生物介质内共存且含量呈逐年上升趋势〔3, 4〕。研究发现, 在大鼠大脑发育的关键期, 暴露于低剂量的PBDEs或PCBs均能导致成年鼠脑功能的异常, 而且随着年龄的增长逐渐恶化〔4〕。PBDE-47与PCB153均能导致细胞凋亡〔5〕, 同时使细胞内钙离子水平发生变化〔6〕, 但其机制尚不完全清楚。本研究采用PBDE-47和PCB153单独及联合对SD大鼠进行染毒, 观察大鼠空间学习、记忆能力的改变, 同时检测钙信号通路相关基因mRNA表达水平的变化, 探讨PBDE-47和PCB153联合染毒对大鼠的神经毒性作用及其机制, 为进一步研究PBDEs的神经毒作用机制提供基础依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器PBDE-47(纯度100%)和PCB153(纯度100%)(美国AccuStandard公司); Trizol提取液(美国GIBCO公司); SYBR PrimeScript TR-PCR试剂盒(大连宝生物有限公司)。其他试剂均为国产分析纯。核酸蛋白分析仪(美国Bio-Rad公司); ABI Prism 7900HT PCR系统(美国ABI公司)。
1.2 方法 1.2.1 PBDE-47、PCB153单独和联合染毒SD大鼠模型建立雌性220~260 g和雄性230~270 g成年Sprague-Dewley (SD)大鼠各30只(华中科技大学同济医学院动物实验中心)。给予正常颗粒饲料饲养1周后, 雌、雄大鼠按1:1同笼。分娩前孕鼠单笼饲养, 自然分娩。出生第10 d将所有仔鼠随机分成8组:1, 5, 10 mg/(kg·bw) PBDE-47组、5 mg/(kg·bw) PCB153组、1 mg/(kg·bw) PBDE-47+5 mg/(kg·bw) PCB153组、5 mg/(kg·bw) PBDE-47+5 mg/(kg·bw) PCB153组、10 mg/(kg·bw) PBDE-47+5 mg/(kg·bw) PCB153组和对照组(大豆油), 每组18只, 雌雄各半, 按10 ml/(kg·bw)经口灌胃进行一次染毒处理。仔鼠出生后第4周处死母鼠, 将仔鼠按性别分笼饲养。
1.2.2 Morris水迷宫定位航行实验定位航行试验分4 d进行, 每天每只大鼠进行4次训练。图像采集系统及分析系统自动记录大鼠的寻台潜伏期、游泳路径。如果60 s内未找到平台, 由实验者将大鼠引上平台并休息30 s, 并将其寻台潜伏期记为60 s。
1.2.3 实时荧光定量RT-PCR 1.2.3.1 大鼠海马提取在出生后60 d时, 各染毒剂量组取雌雄大鼠各3只断头处死并分离海马, 即刻放入液氮, 过夜后转入-80℃保存, 以备检测用。
1.2.3.2 总RNA提取使用Trizol试剂对大鼠海马组织的总RNA进行抽提, 具体步骤参照Trizol试剂说明书进行。
1.2.3.3 RNA纯度与含量测定取2 μl RNA溶液50倍稀释后于核酸蛋白分析仪测定其RNA纯度(以A260/A280表示)与含量。结果显示, 纯度在1.8~2.0之间, 同时利用1%琼脂糖电泳验证RNA的质量良好, 可用于后续试验。
1.2.3.4 实时荧光定量RT-PCR每个样品取2 g总RNA利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA, 反应条件:37℃, 15 min; 85℃, 5 s。以cDNA产物为模板上ABI Prism 7900HT PCR系统进行PCR扩增检测。引物序列及产物长度分别为:X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)上游5'-TGAGGTTCTGATTGCAGATCTTGTG-3';下游5'CTTGTAGGCGCCTTAGCTGCTC-3', 扩增片段为116bp; 死亡相关蛋白激酶(DAPK)上游5'-CTACCAACTCCACCCGCTTC-3', 下游5'-CTCCTCACGCTCACATTCTCAC-3', 扩增片段为106bp; 含半胱氨酸的天冬氨酸酶-12(Caspase-12)上游5'-CAATTCCGACAAACAGCTGAGTTTA-3', 下游5'-CATGGGCCACTCCAACATTTAC-3', 扩增片段为146bp; 含半胱氨酸的天冬氨酸酶-3(Caspase-3)上游5'-GCAGCAGCCTCAAATTGTTGACTA-3', 下游5'-TGCTCCGGCTCAAACCATC-3', 扩增片段为144 bp; 细胞色素C (Cytochrome C)上游5'-GGCAAGCATAAGACTGGACCAA-3', 下游5'-TTTCCAAATACTCCATCAGGGTATC-3', 扩增片段为139bp; 磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上游5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3', 下游5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3', 扩增片段为143 bp。PCR反应如下:预变性, 95℃, 10 s, 然后进行40个循环; 95℃, 5 s; 60℃, 30 s。融解曲线反应条件:95℃, 15 s; 60℃, 1 min; 95℃, 15 s。按SYBR Prime Script RT-PCR Kit试剂盒(大连宝生物公司)进行相对定量分析。
1.3 统计分析采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析, 交互作用单变量方差分析并以最小显著差法(LSD)比较两两差异。
2 结果 2.1 Morris水迷宫定位航行试验(表 1)
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表 1 2月龄大鼠水迷宫定位航行实验结果( x±s, n=12) |
与对照组比较, 所有PBDE-47单剂量染毒组大鼠的潜伏期和路径都明显增加(P < 0.05), 且随着染毒剂量的增加呈现增大的趋势。方差分析结果表明, PCB153和PBDE-47联合染毒对大鼠水迷宫定位航行实验中找到平台的潜伏期和路径的影响存在交互作用(F=13.546, P < 0.01;F=2.956, P < 0.05)。PCB153对PBDE-47染毒大鼠的潜伏期和路径均可产生明显的影响。
2.2 PBDE-47和PCB153对雄性大鼠基因mRNA表达水平影响(表 2)|
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表 2 2月龄雄性大鼠海马钙信号通路相关基因mRNA表达水平( x±s, n=3) |
方差分析结果表明, PBDE-47和PCB153对XIAP、Caspase12、Caspase3以及Cytochrome C mRNA表达水平的影响存在交互作用(F=4.555, P < 0.05;F=3.822, P < 0.05;F=4.230, P < 0.05;F=14.863, P < 0.01)。
2.3 PBDE-47和PCB153对mRNA表达水平的影响(表 3)|
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表 3 2月龄雌性大鼠海马钙信号通路相关基因mRNA表达水平( x±s, n=3) |
方差分析结果表明, PBDE-47和PCB153联合对XIAP、Caspase-12和Caspaces-3 mRNA表达水平的影响存在交互作用(F=3.663, P < 0.05;F=26.184, P < 0.01;F=8.148, P < 0.01)。
3 讨论动物试验已证明, PBDE-47可使大鼠运动行为异常, 成年后记忆与学习能力明显下降〔4〕。本实验也发现, PBDE-47可使2月龄SD大鼠寻找到平台所需要的潜伏期与总路值都显著增长, 且出现了随着PBDE-47剂量增大潜伏期与总路径也随之增大的趋势, 表明PBDE-47可使大鼠的空间记忆与学习能力显著性减退, 导致神经系统出现损伤。同时还发现, PCB153可增强PBDE-47的神经毒性作用。
细胞凋亡在PBDEs的神经毒性作用中起重要作用〔7〕。本实验发现, PBDE-47和PBDE-47与PCB153联合染毒可使大鼠海马区神经细胞内Caspase-12、Caspase-3的mRNA表达水平明显上调, 说明PBDE-47可能引发了内质网途径的细胞凋亡过程, 使内质网Ca2+水平失衡, 诱导Caspase-12途径活化最终激活Caspase-3引起终点凋亡效应的发生。PBDE-47及其与PCB153联合染毒可使雄性大鼠DAPK表达上调, 而对雌性大鼠, PBDE-47却使DAPK表达出现下调的趋势, 且PBDE-47与PCB153联合染毒也出现这一现象, 其原因有待进一步验证。PBDE-47以及其与PCB153联合染毒可使大鼠海马神经细胞内XIAP mRNA表达水平显著下调, 表明PBDE-47可能通过改变钙信号水平而诱导大鼠海马区细胞内线粒体释放Smac蛋白, 该蛋白可使XIAP表达下调, 最终使其对Caspase-3的抑制作用减弱而引发凋亡。PBDE-47单独和与PCB153联合染毒可使雄鼠Cytochrome C表达水平显著性上升, 而雌鼠未出现这一现象, 这一基因表达上的性别差异可能是由于PBDE-47在雄鼠体内参与了线粒体途径的细胞凋亡过程, Cytochrome C有大量表达活化凋亡激活因子1(Apaf-1)并与Caspase-9一起形成凋亡小体, 最终激活Caspase-3导致DNA损伤引发凋亡。而在雌鼠体内, PBDE-47可能通过诱导Smac从线粒体释放, 抑制XIAP表达的同时, 还参与了其他凋亡途径如死亡受体途径, 使得Caspase-3的表达上调, 或者诱导了其他凋亡终点效应基因表达, 引起凋亡的发生。本研究还表明, PBDE-47与PCB153联合在对大鼠海马中某些钙信号诱导凋亡通路中的基因表达水平的影响上存在交互作用, 这可能是由于PCB153参与了通过与PBDE-47类似的钙信号传导通路来诱导大鼠海马组织凋的过程, 目前已有PCB153可使大鼠神经瘤细胞发生凋亡的报道〔8〕, 但具体机制还有待进一步研究。
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