快速、有效和灵敏的诊断是控制结核病的关键之一。目前常用的诊断试剂结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)是一种未被明确成分的结核杆菌抗原混合物，普遍存在于结核杆菌、环境中非结核杆菌等菌株中，检测时常将卡介苗接种者及活动性肺结核治愈者误检为阳性，而且不能将活动性肺结核与潜伏感染相区别，限制了PPD的临床应用^{〔1, 2〕}。MTC28基因仅存在于结核杆菌复合体成员中，该蛋白可被大多数结核病患者和感染者的血清所识别，因此，MTC28有望成为结核病血清学诊断的候选抗原之一^{〔3, 4〕}。本研究克隆MTC28基因，并成功构建原核表达质粒PET-32a-MTC28。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

PET-32a载体、大肠埃希菌DH5α(美国Novagen公司); 结核杆菌H37Rv株(本室保存); 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(美国Axygenbio公司); 限制性内切酶EcoRI, Xho Ⅰ, T4 DNA连接酶、DNA marker (大连TaKaRa宝生物公司); Pfu DNA聚合酶(美国Promega公司)。

1.2 方法 1.2.1 引物设计

参照美国基因数据库(GenBank)公布的序列(登录号：U 7527.1)，扩增目的基因MTC28编码区长度为933 bp。引物由上海生工公司合成。上游引物：5′-CCGGAATTCATGATCCAGATCGCGCGCAC-3′; 下游引物：5′-CCCTCGAGCTAGCGCGGCGGGACTGGT-3′(CCG：上游引物保护性碱基GAATTC：EcoRI内切酶位点CG：下上物保护性碱基CTCGAG：Xho Ⅰ内切酶位点)。

1.2.2 目的基因的扩增

按曲拉通法(略有改进)提取结核杆菌H37Rv株的DNA，以此为模板扩增MTC28全长基因。PCR反应体系：超纯水24.25 μl，50%甘油5 μl，二甲基亚砜(DMSO)2.5 μl，dNTP 4 μl，Pfu buffer 5 μl, 上下游引物各2 μl，模板DNA 5 μl，Pfu聚合酶0.25 μl，总体积50 μl。PCR反应程序：94.0 ℃预变性5 min，进入循环，94.0 ℃变性55 s，62.0 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共30个循环，72 ℃后延伸10 min。产物经琼脂糖凝胶电泳后试剂盒纯化回收。

1.2.3 原核表达载体的构建

碱裂解法提取质粒DNA，用EcoRI和Xho Ⅰ双酶切原核表达载体PET-32a和目的基因MTC28，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后中用酚氯仿抽提法回收，T4连接酶连接，连接产物转化至感受态细胞DH5α。

1.2.4 原核表达载体的鉴定

经氨苄青霉素培养基筛选，挑取阳性菌落进行扩增。当菌液浑浊时，取1 μl菌液进行PCR，PCR反应条件和反应程序同前。同时，取菌液1.4 ml用碱裂解法提取pET-32a-MTC28重组体质粒。利用EocRI和Xho I2种限制性内切酶进行双酶切鉴定，电泳观察结果。阳性克隆质粒送日本TaKaRa公司测序，结果与GenBank公布的序列进行比较分析。

2 结果 2.1 目的基因的扩增(图 1)

扩增的MTC28的全长结构基因为933bp，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳显示，在预期部位出现明显条带。

2.2 原核表达载体的构建与鉴定(图 2)

扩增的MTC28目的基因与PET-32a载体经双酶切后进行连接，基因重组质粒转化至DH5α中。挑取经氨苄青霉素筛选的阳性菌落进行培养，菌落PCR扩增结果及重组质粒酶切鉴定表明MTC28基因已成功克隆于PET-32a载体中。测序结果与GenBank公布的序列一致。

3 讨论

目前，对于发展中国家，痰涂片和分离培养是诊断活动性肺结核最常用的方法，但痰涂片阳性率低(仅27%)、样本收集困难; 分离培养虽然特异但时间长(4~8周)，可行性差。因此，研究者把更多的目光集中在敏感性和特异性较高的血清学诊断上^〔5〕。

MTC28是新近从结核杆菌H37Rv株培养滤液中纯化分离出的蛋白抗原。其基因CDS全长为933个碱基，分子量约为28kDa，由310个氨基酸组成^〔6〕。由于结核杆菌抗原基因GC含量较高，为了进行有效的PCR扩增，在精心设计引物的此基础上对PCR反应条件进行了优化。首先是Pfu聚合酶的使用，Pfu聚合酶是目前已知保真性最高的DNA聚合酶，它扩增出的DNA产物，随机突变少，保真性能为Taq DNA聚合酶的10倍以上; 其次有PCR扩增体系中加入了5%甘油和5%的二甲基亚砜(DMSO)也是PCR扩增成功的关键所在，两者有利于GC含量较高和二级结构多的靶序列的扩增。在PCR扩增成功的基础上，先用PET-32a原核表达载体，该载体具有硫氧还蛋白(Trx)融合标签。MTC28基因经多克隆位点插入后可与Trx一起融合表达，不仅提高了表达蛋白的溶解性而且有利于其正确折叠和二硫键的形成，最大限度的保持其活性。本实验pET-32-MTC28原核表达质粒的成功构建，为下一步研究MTC28分泌蛋白的免疫学特性提供了基础依据。