结核分支杆菌感染者仅有1 /10发病, 提示个体的遗传差异可能在结核发病中扮演着重要角色^〔1〕。CD209基因编码DC-SIGN (dendritic cell-specific ICAM -3 grabbing nonintegrin), 而DC-SIGN是一种典型的C-型凝集素, 是人类树突状细胞主要的结核分支杆菌受体, 能作为细胞粘附受体和微生物识别受体发挥作用。2008年Vannberg等^〔2〕报道非洲人群CD209等位基因-336G是结核病保护因素。不同人群的基因与结核病易感性的关系可能存在差异。本研究于2008年3月~7月在山东省济宁市收集病例, 探讨中国汉族人群-336 CD209 G/A多态性与肺结核易感性的关系, 为肺结核的防治提供新的思路。

以济宁市的县区结核病防治机构为单位, 选取曲阜市(县级市)疾病预防控制中心及任城区结核病防治所为现场, 以确诊的时间为顺序, 从2008年3月开始, 共收集符合标准的新发病例167例。肺结核诊断标准按照《中国结核病防治规划实施工作指南》^〔3〕。排除其他传染病及慢性病(如哮喘、慢性支气管炎、肺炎、肝肾病、尘肺、糖尿病、肿瘤、遗传性过敏、寄生虫病等)的患者, 排除人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者、器官移植者及长期使用激素者。同一时间内, 以就诊的先后顺序, 抽取济宁医学院附属医院及济宁市第一人民医院2所综合医院的门诊患者作为对照, 按年龄和性别与病例进行1:1匹配, 其中年龄相差≤3岁。所有对照均排除结核病史, 其他排除标准同病例组。

采用自行设计的调查表。内容包括基本情况及环境危险因素:年龄、性别、民族、婚姻、职业、文化程度、身高、体重、卡痕、结核病人密切接触史、被动吸烟、吸烟史、饮酒、健身活动、蔬菜水果类摄入、肉蛋奶类摄入、性格、心理健康程度、压力、生活满意度、与他人的关系、人均住房面积、卧室人数、住房类型、采光、通风、潮湿、室内做饭、宠物饲养、室内环境卫生、工作环境化学烟雾、工作环境粉尘、劳动强度、外出打工史、户主的职业、医疗保障类型、人均月收入以及卫生宣传教育。所有条目均尽量使用客观指标, 并有明确定义。所有研究对象均填写知情同意书。

(1)基因组DNA提取:每个研究对象静脉采血1~2 ml, 2%乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂)抗凝。血液基因组DNA小量试剂盒(上海生工公司)抽提基因组, 参照说明书。(2)序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP -PC R); 特异正向引物1为5'-CTCCACTAGGGCAAGGGTA-3', 特异正向引物2为5'CTCCACTAGGGCAAGGGTG-3', 通用反向引物为5'GCAGTGCCTCCTCAGTTT-3'。PCR体系为15 μl, 包括3 μl DNA, 1.5 μl 10×buffer, 0.5U TaqDNA聚合酶, 0.2 mmol/L dNTPs, 1 μl MgCl₂, 正向(1或2)和反向引物各1 μl, 不足体积用灭菌双蒸水补齐。PCR反应循环参数为: 95℃预变性5 min; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 60 s, 35个循环; 72 ℃延伸10 min。每份样本均用2种不同正向引物各扩增1管。引物及试剂(上海生工公司)。(3)基因型识别: PC R产物用2%琼脂糖凝胶在90 V电压下电泳1 h, 紫外灯下观察结果, 自动凝胶成像分析系统成像和分析。同一样本用不同正向引物扩增的2管均出1条281bp条带的是GA基因型, 只能被特异正向引物1扩增出281 bp条带的是AA基因型, 而只能被特异正向引物2扩增出281 bp条带的是GG基因型。

应用SPSS 13.0软件进行分析。计算2组-336CD209基因型频率, 然后经χ²检验验证是否符合Hardy-W eiberg遗传平衡定律。利用单因素条件Logistic回归分析环境因素及基因型, 将差异有统计学意义的因素纳入多因素条件Logistic回归分析, 得到校正基因型的OR以及OR 95% CI。交互作用利用多因素条件Logistic分析。统计检验水准取α=0.05。

病例组和对照组各167例, 年龄分别为16~77岁和15~78岁, 中位数均为43岁, 四分位间距均为30岁; 男性和女性各为110和57例。民族均为汉族。

病例组中携带AA、GA、GG基因型者分别为35例(21.0%), 71例(42.5%), 61例(36.5%), 对照组中携带3种基因型者分别为59例(35.3%), 76例(45.5%), 32例(19.1%)。

表 1

表 1 肺结核与-336CD209基因型单因素条件Logistic回归分析

表 1 肺结核与-336CD209基因型单因素条件Logistic回归分析

以是否患肺结核为因变量, 分别以环境因素以及-336CD209基因型为自变量进行单因素条件Log istic回归分析。结果表明, 环境因素中差异有统计学意义的有文化程度、卡介苗接种史、结核病人密切接触史、体质指数、吸烟史、蔬菜水果摄入、肉蛋奶类摄入、心理健康程度、生活满意度、与他人的关系、卧室人数、房屋类型、采光、通风、室内环境卫生、工作环境粉尘、劳动强度、外出打工史、户主的职业、医疗保障类型以及人均月收入。病例组GG基因型频率显著高于对照组。

表 2

表 2 肺结核与-336CD209基因型多因素条件Logistic回归分析

表 2 肺结核与-336CD209基因型多因素条件Logistic回归分析

以是否患肺结核为因变量, 以基因型为自变量, 以单因素分析差异有统计学意义的环境因素为协变量, 进行多因素条件Logistic回归分析(基于最大似然估计的向后逐步回归法, 引入和剔除的显著性水平分别为0.05和0.1)。

为了便于分析, 将CD209基因-336位点基因型转化为二分类变量, GG基因型与GA基因型合并为GG或GA基因型。

以是否患肺结核为因变量, 以单因素分析中差异有统计学意义的变量以及卡介苗接种史、基因型的乘积项为自变量, 进行多因素条件Logistic回归分析。相乘模型乘积相的β=0.382, 其S_E为0.096, χ²=15.768, OR 95% CI=1.465 (1.213~1.768), P=0.000。因此, 基因型与卡介苗接种史对肺结核有显著的正相乘模型交互作用。

以是否患肺结核为因变量, 以单因素分析中差异有统计学意义的变量以及吸烟史及基因型的乘积项为自变量, 进行多因素条件Logistic回归分析, 相乘模型乘积相的β=0.267, 其S_E为0.070, χ²=14.486, OR 95% CI=1.306(1.138~1.498), P=0.000。因此, 基因型与吸烟史对肺结核有显著的正相乘模型交互作用。

DC-SING是人类树突状细胞主要的结核分支杆菌受体, 直接参与免疫识别和抗原递呈。已有甘露糖结合蛋白基因(MBP)多态性与结核易感性相关的报道^{〔4, 5〕}, 而编码DC -SING的CD209基因与MBP同属于甘露糖结合凝糖结合凝集素家族, 两者结构和功能有众多相似之处。因此, CD209基因多态性从生物学上可能影响肺结核易感性。Barreiro等^〔6〕报道, 南非人群CD209等位基因-336G是结核病保护因素。本研究对国内汉族人群-336CD209G /A多态性与肺结核发病的易感基因型, 这与Barreiro等的结论相似, 但与Vannberg等^〔2〕的报道不同。差异可能是不同人群遗传本底不同造成的。本研究交互作用分析发现, GG和GA基因型与卡介苗接种史以及与吸烟对肺结核均有显著的正相乘模型交互作用, 可能存在生物学上的协同作用, 提示GG或GA基因型、接种卡介苗以及吸烟在对肺结核发病产生影响时并非独立发挥作用, 2种基因型可能增加了未接种卡介苗以及吸烟对肺结核发病的危险。

环境因素影响肺结核的发病^〔7〕, 肺结核可能的易感基因又多为微效基因, 导致其易感基因较难发现。但随着人类基因组计划的完成以及分子流行病学和遗传流行病学的发展, 肺结核遗传易感性研究将为新的结核苗的研制提供思路, 帮助医务人员筛选肺结核高危人群, 采取综合措施^〔8〕预防和控制肺结核。