微生物源追踪(Microbial Source Tracking, MST)是指利用特定的指标物来追踪水体中污染物来源, 以便于对污染进行评价和控制的一门新技术。该方法已成功地解决了美国多条河流和近海的粪便污染问题^{〔1, 2〕}。微生物源追踪技术中目前最常用的方法是抗生素敏感性实验(Antibiotic Resistance Analysis, ARA)。该方法利用不同来源指示菌对不同种类和浓度的抗生素敏感性不同来查找污染来源, 在欧美等国家已被普遍应用。但是, 国内此方面应用和报道较少。本研究以大肠埃希菌为指示菌, 选择9种抗生素, 根据特征性耐药谱筛选出能区分其不同来源的抗生素浓度, 用判别分析检验其效果, 建立适用我国水体使用的ARA方法。

(1)标本:新鲜粪便标本、水库表层水样。(2)主要试剂与仪器:改良粪大肠埃希菌(mFC)培养基(美国BD公司); 胰蛋白大豆琼脂(TSA)培养基(北京陆桥公司); 含有4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷的大肠埃希菌肉汤(EC-MUG)培养基(美国Difco公司); API20E生化反应试条(法国生物梅里埃公司); 青霉素G、利福平(美国Sigma公司); 环丙沙星、四环素、头孢拉定、链霉素、新霉素、氟苯尼考、红霉素(德国Dr Ehrenstorfer公司); 复制叉(美国Sigma公司); 手提式紫外分析仪(江苏金坛盛蓝公司); 六联过滤器(德国Sartorius AG)公司。

(1)标本采集:在淮河流域某水库上、中、下游选择5个自然村采集人、家禽(鸡、鸭、鹅)、家畜(猪、牛、羊)、狗、野生动物新鲜粪便标本60份, 采集水库表层水(水面下20 cm) 10份, 均置于冷藏箱中于6 h内送达实验室。(2)指示菌分离:称取10 g粪便标本用磷酸盐缓冲液(pH 7.2)进行倍比稀释(10^-1~10^-6), 各吸取每个稀释度溶液25, 100 μl, 分别置于mFC培养基上, 用L型玻璃棒涂抹均匀后置于37 ℃孵箱中孵育24 h。每份水样各量取25, 50, 100, 150, 200 ml, 分别过滤后取滤膜置于mFC平板表面, 先在孵箱中于44.5 ℃孵育2 h, 然后于37 ℃卵育22 h。(3)指示菌确定:选取mFC平板上蓝色可疑菌落, 转种至装有200 μl EC-MUG培养基的96孔培养板中, 37 ℃孵育24 h后在365 nm紫外灯光下观察, 发荧光且经API20E确认为大肠埃希菌者置于含30%甘油的营养肉汤中, -80 ℃冻存备用, 每份粪便和水样标本至少分别选取8和10株菌。(4)抗生素浓度筛选:以文献^{〔3, 4〕}为参考并结合当地实际情况选择青霉素G、利福平、环丙沙星、四环素、头孢拉定、链霉素、新霉素、氟苯尼考和红霉素, 分别加到TSA培养基中, 制成含不同浓度(0.25~80 μg/ml)抗生素的ARA平板。分离的大肠埃希菌转种至装有EC-MUG培养基的96孔培养板中, 用复制叉转印到上述ARA平板表面, 每批ARA试验均有2个不含抗生素的TSA平板作为空白对照。37 ℃孵育24 h后, 不同细菌根据其生长情况记录为0~5分值等级(0和5分别表示完全抑制和完全不抑制生长)。

应用JMP 7.0软件进行最大似然法, 判别分析以验证ARA区分不同来源的效果, 从而筛选出能区分指示菌不同来源的抗生素浓度。

从各种已知源粪便标本及水样标本中分离并确认为大肠埃希菌的指示菌共计589株; 其中人源株142株, 家禽(鸡、鸭、鹅)和家畜(猪、牛、羊)来源株分别为133和160株, 狗来源株30株, 野生动物来源株24株, 水样标本来源株100株。

达到最佳判别效果时TSA平板中包含的抗生素药物浓度如下:头孢拉定5, 7.5, 10, 12.5, 15 μg/ml; 环丙沙星0.25, 0.5, 1 μg/ml; 红梅素15, 17.5, 25, 35 μg/ml; 氟苯尼考5, 7.5, 10, 15 μg/ml; 新霉素0.25, 0.5, 0.75, 1 μg/ml; 青霉素G20, 40, 80 μg/ml; 利福平7.5, 10, 15, 20 μg/ml; 链霉素1, 2, 3, 5 μg/ml; 四环素5, 10, 20, 30 μg/ml。

当已知来源的标本分为人和动物2大类时, 正确归类最高, 达93.05% (455/489), 其中人来源株和动物来源株正确归类率分别为88.73%(126/142)和94.81%(329/347);已知来源菌株分为人、家禽和家畜3大类时, 正确归类率为85.75%(373/435), 其中人、家禽、家畜来源株正确归类率分别为88.73%(126/142), 83.46%(%111/133), 85.00%(136/160);已知来源菌株分为9类(人、鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、狗和野生动物)时其正确归类率为78.53%。

100株指示菌中有58株来自家畜, 25株来自家禽, 11株来自狗, 2株来自野生动物, 仅4株来自人。占据污染来源前3位的分别是猪36株、鸡17株、牛16株。

本实验选取美国环境保护署推荐的大肠埃希菌^〔5〕为指示菌, 通过mFC与EC-MUG培养基相结合的方法进行分离培养指示菌, 分离效果较好, 特异性高。抗生素筛选结果显示, 青霉素G浓度最高, 环丙沙星和新霉素浓度最低, 与国外报道相似^〔6〕。这可能与青霉素G对革兰阴性杆菌较不敏感、新霉素不常用、环丙沙星较少用于动物而在人类中使用较广泛有关。

目前, 针对微生物源追踪ARA结果的分析主要有判别分析和聚类分析2种^〔7〕。本研究选用前者, 通过计算正确归类率对已知来源的ARA数据库进行评价。结果显示, 正确归类率随分类种类增多而不断降低, 从最高的超过93%降至78%, 与Hagedorn^〔8〕和Graves^〔9〕的报道相似。本研究提示, 该水库中主要粪便污染来源为猪、牛和鸡, 与当地猪饲养废弃物管理不善, 牛、鸡散养于水库边实际情况一致。