傣族“雅解”药材-牙海补乌^{〔1, 2〕}在植物学分类中为冰糖草(Bingtangcao)，别名土干菜、野甘草等，属玄参科，主要分布于云南省西双版纳地区。具有清热解毒，利尿消肿等作用^〔3〕。为深入研究该类药材对人体的保健功能，开发其中抗氧化(解除各种毒素，防治各种疾病)的活性成分，本研究选择傣族传统药材-牙海补乌，制备其提取物，进行体外清除羟自由基(·OH)、超氧自由基(O₂^-·)及抑制·OH所致脂质过氧化和对DNA氧化损伤作用的研究。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

(1)牙海补乌药材：根块，干品(云南西双版纳傣医院); (2)对照标准品：芦丁，含量≥99%(美国Sigma公司)。(3)试剂与仪器:小牛胸腺DNA (ctDNA); pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)0.15 mol/L; 核黄素溶液3.3 ×10^-6 mol/L (pH 7.4 PBS配制); 蛋氨酸溶液0.01 mol/L (pH 7.4 PBS配制); 氯化硝基四氮唑蓝(NBT)4.6×10^-5 mol/L (pH 7.4 PBS配制); 番红花红溶液40 μg/ml; EDTA-Fe (Ⅱ)溶液0.945 mmol/L (临用前配制); 3% H₂O₂溶液(临用前配制); 卵磷脂溶液：6.7 mg/ml (用200 mg卵磷脂溶解于30 ml的10 mmol/L，pH 7.4 PBS配制，冰浴震荡); 2-硫代巴比妥酸(TBA)溶液1%(W/V); 三氯乙酸(TCA)溶液28%(W/V)(临用前配制)。7200型可见分光光度计(上海尤尼柯上海仪器有限公司); 光照箱(自制, 灯功率18w)，超声清洗器。试剂均为分析纯; 实验用水为离子交换纯水。

1.2 方法 1.2.1 牙海补乌多糖提取物制备

用水提醇沉法^〔4〕提取，得到的固体真空干燥，为牙海补乌多糖粗提取物，准确称取上述提取物500.0 mg，用2次蒸馏水溶解后，用水定容至100.0 ml，制得5.0 mg/ml牙海补乌提取物溶液。

1.2.2 总糖含量分析

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量^〔5〕，以葡萄糖为标准品，用分光光度法测定，波长425 nm。根据标准曲线计算样品中粗多糖含量，计算牙海补乌多糖获得率。

1.2.3 清除羟自由基活性测定

采用Fenton反应-番红花红褪色分光光度法^〔6〕。取pH 7.4的磷酸盐缓冲液1.0 ml，40 μg/ml番红花红1.0 ml，0.945 mmol/L乙二胺四乙酸二钠铁盐(EDTA-Fe)(Ⅱ)(新鲜配置)1.0 ml，牙海补乌多糖提取物(样品)或芦丁标准品(对照)溶液0.5 ml，3 % H₂O₂ 1.0 ml (新鲜配置)，混合后在37 ℃水浴中反应30 min, 然后在(520±1) nm处测定吸光度(A_s)值。空白组以0.5 ml蒸馏水代替样品测定吸光度A₀，对照组以1.5 ml蒸馏水代替H₂O₂和样品测定吸光度A，用3.5 ml蒸馏水代替番红花红、EDTA-Fe (Ⅱ)、H₂O₂、样品，用1.0 ml磷酸盐缓冲液调零。计算清除率(D%)。

1.2.4 清除氧自由基活性测定

参照文献〔7〕方法，用pH值为7.8的0.05 mol/L混合磷酸盐缓冲液为溶剂，配制含3.3×10^-6mol/L核黄素，0.01 mol/L蛋氨酸，4.6×10^-5 mol/L氯化硝基四氮唑蓝(NBT)及各种浓度的牙海补乌多提取物溶液，在25 ℃下，置于光照箱光照30 min，取出后以蒸馏水作为参比液，测定λ560 nm处吸光度(A)值，同时以水代替牙海补乌多提取物溶液测定空白吸光度(A₀)值，计算清除率(D%)。

1.2.5 脂质过氧化抑制活性的测定

以卵磷脂脂质体为模型^〔8〕，取0.5 ml的6.7 mg/ml卵磷脂溶液，加入pH 7.4的PBS 1.0 ml，不同浓度的样品溶液1 ml，2.5 mmol/L的EDTA-Fe (Ⅱ) 1.0 ml，混匀后于37 ℃水浴中反应45 min，再加入28%(W/V)的TCA 2.0 ml，1%(W/V)的TBA 1.0 ml，混匀后置于100℃沸水浴中加热10 min，冷却后在532nm处测定吸光度A_样，用PBS调零，空白管用PBS代替样品测吸光度A₀值，并计算抑制率。

1.2.6 抑制羟自由基引发DNA氧化损伤的活性测定

采用硫代巴比妥(TBA)法^〔8〕进行检测。取2 μg DNA，加入2 ml pH 8.2 Tris-HCl缓冲液，取0.1，0.2，0.4，0.6 μg/ml浓度的牙海补乌多糖提取物溶液，2 ml的200 μmol/L Fe²⁺溶液，2 ml的20 mmol/L H₂O₂溶液，定容至10 ml，混匀，37 ℃保温48 h后，水浴加热30 min，检测532 nm处吸光度。

2 结果 2.1 牙海补乌多糖含量测定

以葡萄糖为标准，苯酚-硫酸法分光光度法测定标准曲线回归方程为：y=9.211 x+0.0533，相关系数r=0.9997。在本提取条件下，牙海补乌粗多糖提取物获得率为12.4%，多糖含量为33.1%，多糖收率4.1%。

2.2 对羟自由基的清除作用

牙海补乌多糖提取物溶液与芦丁进行对照研究，牙海补乌多糖提取物对Fenton反应产生羟自由基有较强的清除作用，清除作用随浓度增加而增加，清除率为50%时牙海补乌多糖提取物半数致死浓度(IC₅₀)为IC₅₀=0.0028 mg/ml，当浓度达0.018 mg/ml时，清除率达最大，其最大清除率为88.1%。而对照品芦丁IC₅₀=0.002 5 mg/ml，最大清除率为86.8%(0.011 mg/ml)。说明牙海补乌多糖提取物IC₅₀与芦丁相近，对羟自由基的最大清除率略高于芦丁，说明牙海补乌多糖提取物溶液对羟自由基的清除效果较明显，与芦丁相近。

2.3 对氧自由基的清除作用

牙海补乌多糖提取物溶液对光照核黄素产生氧自由基的清除作用随浓度增加而增加，IC₅₀=0.057 mg/ml，浓度为0.11 mg/ml时对氧自由基的清除率达最大，最大清除率为68.3%。对照物芦丁IC₅₀=0.050 mg/ml，最大清除率为76.92%(0.1 mg/ml)。结果表明，牙海补乌多糖提取物对氧自由基的清除作用较好，但略低于芦丁，原因可能与所用牙海补乌多糖提取物纯度(33.1%)低于芦丁(≥99%)有关。改变光照时间，进一步观察牙海补乌多糖提取物对氧自由基清除能力的动态变化，并与抗坏血酸(VC)进行比较。结果显示，抗坏血酸对光照核黄素产生的氧自由基有较好的清除效果，但效果只能保持较短的时间，超过10 min后，随着时间增加，清除率迅速下降; 而牙海补乌多糖对光照核黄素产生的氧自由基清除作用不随时间增加下降。

2.4 对脂质过氧化的抑制作用

本文以Fe²⁺为脂质过氧化促进剂，以卵磷脂脂质体为模型，在532 nm下测定本法所得的提取物对卵磷脂脂质过氧化的抑制作用，结果，当抑制率达到50%时，牙海补乌多糖提取物浓度IC₅₀=0.149 mg/ml，最高抑制率为71.0%(1.3 mg/ml)，芦丁IC₅₀=0.083 mg/ml，最大抑制率为82.1%(0.5 mg/ml)，考虑到牙海补乌提取物含量为33.1%，低于芦丁(含量≥99%)，可以认为牙海补乌多糖提取物对卵磷脂脂质过氧化抑制作用较好。

2.4 对羟自由基引发DNA氧化损伤的抑制作用(表 1)

硫代巴比妥酸(TBA)可与丙二醛(MDA)类似物反应生成粉红色物质，该物质在532 nm处有最大光吸收，采用TBA反应可定量检测脱氧核糖或DNA上脱氧核糖环的受·OH攻击氧化断裂产生的丙二醛类似物^〔8〕。本文选择DNA为羟自由基靶底物，结果显示，未加牙海补乌提取物溶液时，体系有较大的吸收值，说明羟自由基能对DNA的脱氧核糖进行攻击，使糖环断裂，产生丙二醛类似物，加入牙海补乌提取物后，吸收值明显减小，表明丙二醛类似物产生减小，DNA氧化损伤被抑制，抑制率随牙海补乌提取物溶液浓度增加而增加，表明牙海补乌提取物溶液能有效抑制MDA生成，对DNA上脱氧核糖的氧化损伤抑制作用较好。

3 讨论

本研究结果表明，牙海补乌多糖收率4.1%，提取物多糖的含量为33.1%，说明是一种多糖含量较高的药物。研究表明^〔9〕，植物多糖具有清除自由基和抗氧化作用。本实验结果证实，牙海补乌多糖提取物能够有效地清除·OH及O₂^-·，并且动力学稳定性较好，另外，牙海补乌多糖还能有效抑制脂质过氧化和DNA丙二醛类似物产生。因此，认为植物多糖是傣族传统解毒药牙海补乌活性成分。

本研究表明，傣族传统解毒药牙海补乌具有明显的清除自由基和抗氧化作用，而脂质过氧化很可能是各种毒物中毒的重要机制之一^〔10-12〕，中毒可导致自由基代谢紊乱，各种类型氧自由基，如超氧阴离子、羟自由基等含量显著增加，由此引起的膜脂质过氧化程度加重，从而造成广泛组织细胞损害。因此，可认为清除自由基和抗氧化作用是“雅解"药解毒的重要科学基础。