急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是全身炎症导致多器官功能障碍综合征的肺部表现，其严重阶段即为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)。研究表明，在ALI/ARDS的发生发展中，免疫细胞功能紊乱和免疫炎性因子失衡在致病过程中作用显著^〔1〕。叶黄素是一种类胡萝卜素，主要以全反式异构体形式存在于自然界海洋动物体、藻体及多数陆生植物体(如菊花、酸浆)内并具有多种生物学功能，其中尤以抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力和抗癌作用突出^〔2〕。本实验旨在通过叶黄素对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤模型进行研究，揭示其对此类损伤潜在的预防保护作用。

叶黄素乳化颗粒(瑞士罗氏DMS公司); 脂多糖、地塞米松(美国SIGMA公司); 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗大鼠CD3单克隆抗体、PE标记的抗大鼠CD4和CD8单克隆抗体(美国Caltag公司); 小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α) ELISA试剂盒(武汉博士德公司); 小鼠白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素10(IL-10) ELISA试剂盒(美国RB公司); 丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒及髓过氧化酶(MPO)测定试剂盒(南京建成生物工程公司)。Labconco冰冻真空干燥仪(法国乐高公司); 752分光光度计(中国伯乐公司); 960型荧光分光光度计、J2-SH高速冰冻离心机(均为日本岛津公司); C30柱(YMC Carotenoid S-5，美国Waters公司); 高效液相色谱(HPLC，美国Waters公司); 600E溶剂输送系统，PDA-2996二极管阵列检测器(美国Waters公司); 叶黄素乳化颗粒(瑞士罗氏DMS公司)。

称取10 g叶黄素乳化颗粒加入少许水，加入300 ml丙酮-正己烷萃取。静置2 h后，将脂溶性相收集。再利用减压旋转蒸发仪进行提取液浓缩处理。(1)装柱：将活化好的氧化铝装填于玻璃层析柱中，正己烷润湿。(2)洗脱：分别取2 ml叶黄素提取液上柱，用50 ml正己烷-丙酮淋洗，收集洗脱液。氮气吹干制粉，装入充满氮气的玻璃瓶内，-70 ℃储存备用。

参照全反式叶黄素标准品，根据高效液相色谱(HPLC)中保留时间和紫外可见吸收光谱的特征峰进行鉴定。得到的叶黄素提取液经过过滤后用高效液相色谱分离。色谱条件：色谱柱：Waters YMC Carotenoid S-5(4.6 mm×250 mm); 流动相A：乙腈-甲醇(75:25);流动相B：MTBE; 流动相A与B中分别加入0.05%三乙胺作为改性剂防止叶黄素降解; 线性梯度洗脱：B在8 min内由0增加至55%;8~35 min B维持55%;35~40 min B由55%减至0;流速：1.0 ml/min; 检测波长：λ/nm=475;波长范围260~700 nm; 进样量：20 μl。并收集后观察其光谱特征峰行为。结果表明，实验所用灌胃物为全反式叶黄素，纯度为95%。

实验小鼠60只(中国军事医学科学院实验动物养殖中心); 按体重随机分为6组：正常对照组、急性肺损伤(ALI)模型组、地塞米松阳性对照组(5 mg/kg)以及叶黄素10，15，20 mg/kg 3个剂量组，每组10只。叶黄素组动物每天给予不同剂量的叶黄素，其他组均给予等量的食用色拉油，连续灌胃30 d，每周称体重1次，根据体重调整灌胃量。30 d后，叶黄素各剂量组、ALI模型组、地塞米松组小鼠分别腹腔注射细菌脂多糖(LPS)6.0 mg/kg，建立实验动物ALI模型，正常对照组小鼠腹腔注射生理盐水。造模6 h后，股动脉放血处死，结扎右肺，暴露气管进行气管插管，用生理盐水1.5 ml分3次进行支气管肺泡灌洗，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，取BALF离心后上清2 ml冷冻干燥成干粉; 并收集小鼠腹主动脉血。

(1)肺湿重/干重比测定：各组小鼠开胸取全部左肺，称取湿重，60 ℃烘烤48 h，称取干重，计算肺组织湿重/干重比(即W/D)。(2)肺组织相关因子检测：取肺组织匀浆液，采用酶联免疫吸附法测定各组小鼠肺组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素10(IL-10)含量，按试剂盒说明书测定中性粒细胞髓过氧化物酶(MPO)。

采集小鼠腹主动脉血2.0 ml，EDTA抗凝后分别取60 μl加入2个流式细胞仪检测专用试管中。具体操作参照文献〔3〕。

经3 000 r/min离心10 min，分离血清，测定各组血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)水平。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法; SOD活性测定采用亚硝酸盐法; GSH-Px活性测定采用5，5-双硫代对硝基苯甲酸(DTNB)显色法。

生理盐水300 μl溶解BALF干粉，分别用TNF-α和IL-8酶联免疫试剂盒测定。

采用SPSS 10.0软件进行统计分析，组间差异比较用单因素方差分析。

ALI模型组的肺组织W/D与对照组相比明显增加(P < 0.01);而与ALI模型组叶黄素各剂量组和地塞米松阳性组肺组织W/D明显降低(P < 0.01)，其中叶黄素不同处理组显示出一定的剂量-反应关系，但叶黄素组疗效不如地塞米松阳性组(P < 0.01)。

表 1

表 1 肺组织TNF-α、IL-10及MPO含量(x±s, n=10)

表 1 肺组织TNF-α、IL-10及MPO含量(x±s, n=10)

与正常对照组比较，ALI模型组小鼠肺组织TNF-α、MPO含量显著升高(P < 0.01)，而IL-10含量显著降低(P < 0.01)。与ALI模型组比较，叶黄素各剂量组和地塞米松阳性组IL-10含量明显升高，TNF-α、MPO含量明显降低(P < 0.01)，其中叶黄素不同处理组显示出一定的剂量-反应关系，但叶黄素组疗效不如地塞米松阳性组(P < 0.01)。

表 2

表 2 动脉血T淋巴细胞亚群CD3+，CD4+和CD8+阳性率(x±s, n=10)

表 2 动脉血T淋巴细胞亚群CD3+，CD4+和CD8+阳性率(x±s, n=10)

与正常对照组比较，ALI模型组小鼠动脉血中T淋巴细胞亚群CD₃⁺，CD₄⁺和CD₈⁺含量显著降低(P < 0.01)。与ALI模型组比较，叶黄素各剂量组和地塞米松阳性组T淋巴细胞亚群CD₃⁺，CD₄⁺和CD₈⁺明显升高(P < 0.01)，其中叶黄素不同处理组显示出一定的剂量-反应关系，但叶黄素组疗效不如地塞米松阳性组(P < 0.01)。

表 3

表 3 血清SOD、GSH-Px活性和MDA含量(x±s, n=10)

表 3 血清SOD、GSH-Px活性和MDA含量(x±s, n=10)

与正常对照组比较，ALI模型组小鼠血中SOD、GSH-Px活性显著降低(P < 0.01)，而MDA含量显著增加(P < 0.01)。与ALI模型组比较，叶黄素各剂量组和地塞米松阳性组血中SOD、GSH-Px活性明显升高，MDA含量明显降低(P < 0.01)，其中叶黄素不同处理组显示出一定的剂量-反应关系，但叶黄素组疗效不如地塞米松阳性组(P < 0.01)。

表 4

表 4 肺BALF中TNF-α、IL-8含量(x±s，n=10)

表 4 肺BALF中TNF-α、IL-8含量(x±s，n=10)

与正常对照组比较，ALI模型组小鼠肺组织BALF中TNF-α、IL-8含量显著升高(P < 0.01)。与ALI模型组比较，叶黄素各剂量组和地塞米松阳性组TNF-α、IL-8含量明显降低(P < 0.01)，其中叶黄素不同处理组显示出一定的剂量-反应关系，但叶黄素组疗效不如地塞米松阳性组(P < 0.01)。

诱发ALI的因素众多，免疫细胞过度活化和免疫炎性因子大量释放，导致病理损伤，引起系统性炎性反应综合征(SIRS)，最终导致机体的病理损害甚至死亡^{〔4, 5〕}。研究表明，当机体摄入脂多糖(LPS)，体内肺组织细胞中的自由基代谢平衡就会失调，对自由基的防御能力也会下降，不饱和脂肪酸过氧化而形成脂质过氧化产物及其代谢产物MDA，最后导致细胞无法维持正常代谢而死亡^{〔6, 7〕}。本实验结果表明，与ALI模型组比较，叶黄素各剂量组均升高血SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，说明叶黄素可以改善LPS所致ALI模型小鼠抗氧化能力。

研究表明，T淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测。辅助性T细胞功能低下，机体易发生感染，抑制性T细胞功能低下可能发生过强免疫反应^{〔8, 9〕}。本研究结果显示，ALI组小鼠CD₃⁺，CD₄⁺、CD₈⁺有降低趋势，而叶黄素不同剂量组均高于ALI组。

TNF-α是ALI炎症反应中重要的启动因子，也是介导早期ALI的主要细胞因子。它可以直接损伤肺血管内皮细胞，介导炎症反应损伤肺组织^〔10〕。L-8是嗜中性粒细胞(PMN)最有效和最主要的趋化因子，ALI时L-8升高较晚但持续时间长，因此，L-8在ALI发病后期损伤及预后转归上起着更为重要的作用^〔11〕。而L-10为抗炎因子，主要是由单核/巨噬细胞、T细胞、B细胞产生，影响前炎症细胞因子的产生^〔12〕。本实验结果表明，叶黄素呈剂量依赖性地抑制TNF-α、IL-8的分泌，而提高L-10。

综上所述，叶黄素能降低由于LPS诱发的肺组织W/D、TNF-α、IL-8、MPO活性升高，增强IL-10分泌与抗氧化能力，改善T淋巴细胞亚群CD₃⁺，CD₄⁺、CD₈⁺分布，但作用不弱于地塞米松，表明叶黄素可能通过调节促炎性因子、抗炎因子的释放以及拮抗氧应激产生保护作用，其确切机制有待进一步研究。