内皮细胞功能不全在糖尿病血管病变的病理生理过程中起关键作用。多种途径可引起糖尿病内皮细胞功能不全，包括过度氧化应激和炎症反应^{〔1, 2〕}。羟甲基戊二酰辅A (HMG-CoA)还原酶抑制剂他汀类药物对心血管具有多种药理效应，包括改善内皮细胞功能。但他汀类药物改善内皮细胞功能的机制尚不清楚。本实验以链脲佐菌素诱发I型糖尿病大鼠动物模型，通过检测阿托伐他汀干预后血管粘附分子-1(VCAM-1)、胞间粘附分子-1(ICAM-1)及非特异炎症因子C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-a (TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)的蛋白表达，观察以阿托伐他汀为代表的他汀类药物对I型糖尿病大鼠炎性反应的影响，探讨阿托伐他汀改善内皮细胞功能的机制。

(1)实验动物：8周龄雄性SD大鼠，24只，体重300~320 g (上海实验动物中心)。(2)试剂与仪器：链脲佐菌素(STZ; 美国Sigma公司); 阿托伐他汀(美国辉瑞公司); 放射免疫试验试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免所); 核酸裂解液(TRIzol)试剂(美国Invitrogen公司); 焦碳酸二乙酯(DEPC; 美国Sigma公司); Beckmancoulter CX5全自动生化分析仪(美国Beckman公司); ABI PRISM 7900 Sequence Detector (美国ABI公司); 双光镜免疫浊度仪及配套试剂(美国Beckman公司)。

大鼠自由进食与饮水, 室内温度保持在20~25 ℃, 相对湿度50%~60%。随机分为无糖尿病大鼠对照组、I型糖尿病大鼠对照组、糖尿病大鼠阿托伐他汀干预组3组，每组8只。除无糖尿病大鼠对照组外, 其余16只大鼠腹腔注射链脲佐菌素70 mg/(kg·d)，连续2 d诱导建立I型糖尿病模型, 监测血糖浓度，血糖浓度>16.5 mmol/L确定为I型糖尿病大鼠; 糖尿病大鼠阿托伐他汀干预组：随机选择8只I型糖尿病模型大鼠，喂饲阿托伐他汀50 mg/(kg·d), 连续喂饲48 d进行干预。

采集各组大鼠空腹静脉血标本，全自动生化分析仪测定空腹血糖、血清甘油三酯、总胆固醇、低密度和高密度脂蛋白含量。双光镜免疫浊度仪速率散射比浊法测定血清C反应蛋白(CRP); 采用放射免疫法测定血清肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-1β。

喂饲48 d后，断头处死大鼠，立即采取主动脉壁组织，存于液氮中备用。总RNA提取采用异硫氰酸胍一步法提取，最后溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，260 nm处测定RNA浓度及纯度，1%琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性。cDNA合成以寡聚脱氧胸腺核苷酸〔oligonucleotide (deoxythymidine)，oligo (dT)〕为引物，采用禽白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus, AMV)逆转录酶催化合成cDNA第一链，产物存于-80 ℃备用。定量PCR所用引物和探针序列：ICAM1：5′GTCTCATGCCCGTGAAATTATG3′，5′CATTTTCTCCCAGGCATTCTCT3′，探针5′TCAATCCCTGCATGCCTCCAC3′; VCAM1：5′GGAGGTCTACTCATTCCCTGAAGA3′，5′ACCGTGCAGTTGACAGTGACA3′，探针5′TGAAATAAGTGGACCACTTGTACACGGGAGA3′; TNFα：5′AGACCCTCACACTCAGATCATCTTC3′，5′CTCCGCTTGGTGGTTTGC3′，探针5′TCGAGTGACAAGCCCGTAGCCCA3′; IL1β：5′CTTCGAGATGAACAACAAAAATGC3′，5′GGAGAATACCACTTGTTGGCTTATG3′，探针5′TGAGCTGAAAGCTCTCCACCTCAATGG3′。PCR反应体积为20 μl，其中含1 μl cDNA，2 μl PCR缓冲液，3.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，上下游引物各0.5 μmol/L，探针0.2 μmol/L及1 U Taq DNA聚合酶。采用ABI PRISM 7900 Sequence Detector进行荧光实时定量PCR (Q-RT-PCR)测定。扩增循环条件：95 ℃热启动10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。结果以目标基因与三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因表达的比值表示。

采用SPSS 11.0软件进行统计分析。计量资料采用x±s表示，组间比较采用t检验。

表 1

表 1 各组大鼠体重、空腹血糖及血脂比较(n=8, x±s)

表 1 各组大鼠体重、空腹血糖及血脂比较(n=8, x±s)

表 1可见，糖尿病大鼠对照组和糖尿病大鼠阿托伐他汀干预组的血糖含量明显高于无糖尿病大鼠对照组(P < 0.05)。实验性I型糖尿病大鼠血清甘油三酸酯、总胆固醇、低密度脂蛋白较正常对照组均明显升高(P < 0.05);阿托伐他汀干预组与糖尿病对照组比较，甘油三酸酯、总胆固醇、低密度脂蛋白含量的差异无统计学意义(P>0.05)，表明低剂量阿托伐他汀干预不影响糖尿病大鼠血清脂质水平。

表 2

表 2 血清中炎症介质含量(n=8, x±s)

表 2 血清中炎症介质含量(n=8, x±s)

表 2可见，与无糖尿病对照组比较, 糖尿病组大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β浓度升高; 阿托伐他汀干预组与糖尿病对照组比较，CRP、TNF-α、IL-1β浓度降低。表明阿托伐他汀可降低血清中炎症介质含量; 与无糖尿病对照组比较, 阿托伐他汀干预组大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β浓度略高, 但差异无统计学意义(P>0.05)。

表 3

表 3 主动脉壁组织中炎症因子基因表达与GAPDH基因表达的比值(n=8, x±s)

表 3 主动脉壁组织中炎症因子基因表达与GAPDH基因表达的比值(n=8, x±s)

RT-PCR结果显示，糖尿病大鼠主动脉壁组织中ICAM-1、VCAM-1mRNA的表达较无糖尿病组均明显上调，分别升高4、2.5倍(P < 0.05)。而阿托伐他汀干预后大鼠主动脉壁组织中ICAM-1、VCAM-1 mRNA的表达较糖尿病大鼠组分别降低了61%和20%(P < 0.05)。糖尿病大鼠主动脉壁组织中TNF-α、IL-1β mRNA的表达较无糖尿病组均明显上调，分别升高5.6，2.9倍(P < 0.05)。阿托伐他汀干预后大鼠主动脉壁组织中TNF-α、IL-1β mRNA的表达较糖尿病大鼠组分别降低了59%和50%(P < 0.05)。

研究表明，在不同的糖尿病动物模型^{〔3, 4〕}及I型糖尿病和2型糖尿病人中均存在内皮依赖性血管舒张功能损害^{〔5, 6〕}, 提示炎症反应在糖尿病血管内皮细胞功能不全的发生发展过程中扮演了重要的角色。CRP被公认为是最有价值的急性时相反应蛋白，它的升高可以提示许多炎症事件的发生。CRP是炎性淋巴因子IL-6、IL-1，TNF-α刺激肝脏上皮细胞合成的。研究发现，CRP、TNF-α、IL-1β均与糖尿病血管病变的发生、发展和预后密切相关^〔7-9〕。

本实验结果表明，糖尿病大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β水平均高于正常对照组, 提示糖尿病大鼠体内非特异性炎症因子合成增加，并且细胞表面粘附分子如VCAM、ICAM等也直接参与了糖尿病大鼠的炎性反应。他汀类药物作为一种降血脂药物被广泛应用于临床。研究提示，他汀类药物也能改善心血管疾病的血管内皮功能。他汀类药物改善糖尿病的内皮功能的机制，似乎与其降低胆固醇水平的作用无关^〔10〕，而与其抑制炎症过程有密切关系。本实验结果表明，小剂量阿托伐他汀(不足以产生降血脂作用)对糖尿病大鼠进行干预后，大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β水平明显降低, 主动脉壁组织中VCAM-1、ICAM-1及非特异炎症因子(TNF-α、IL-1β) mRNA的表达明显降低，说明小剂量阿托伐他汀可抑制糖尿病大鼠的炎性反应，其作用与阿托伐他汀降血脂功能无关，其分子机制有待于进一步研究。