多环芳烃(PAHs)是一类具有三致作用并在全球广泛分布的有机污染物，对人体健康具有潜在危害^〔1〕。PAHs可通过呼吸道、皮肤接触、消化道等多种暴露途径进入人体，经体内代谢成羟基多环芳烃(OH-PAHs)，并以葡萄糖醛酸、硫磺酸结合物的形式主要通过尿液排泄^〔2〕。目前，国际上广泛利用尿液中OH-PAHs作为生物标志物，对PAHs在人体内的暴露水平进行综合评价^〔3〕。高效液相色谱(HPLC)因具有快速、灵敏、易推广等特点，被普遍用于尿液中OH-PAHs的分析。迄今，使用HPLC同时检测尿液OH-PAHs一般在2~8种^{〔4, 5〕}。本文在王宇等^〔6〕同时检测5种OH-PAHs的基础上，对方法进行改进与完善，实现了10种OH-PAHs的同时检测。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

HP1100高效液相色谱仪、荧光检测器(美国Agilent公司); 十二孔固相萃取装置(美国Supeclo公司); 固相萃取visiprep^TM小柱(C-18 ENVI，美国Supeclo公司); 氮吹仪(美国Pierce公司); Phenomenex Prodisy ODS (2)反相柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，C-18预柱(ODS octadecyl, phenomenex), 0.2 μm聚四氟乙烯膜滤头(上海安谱科学仪器有限公司)。1-羟基萘、2-羟基萘、2-羟基芴、9-羟基菲、1-羟基芘(美国Sigma公司); 2-羟基菲、3-羟基菲和4-羟基菲(德国Dr Ehrenstorfer公司); 3-羟基苯并(a)芘(美国the NCI Chemical Carcinogen Repositories公司); 6-羟基䓛(美国Accustaudard公司); 色谱纯甲醇等有机溶剂(德国Merck公司); 水为二次蒸馏水; β-葡萄糖苷酸-芳基硫酸酯酶(每毫升中含122 400单位β-葡糖苷酸酯酶和3 610单位芳基硫酸酯酶，美国Sigma公司)。

1.2 标准溶液

分别用甲醇配制10种OH-PAHs标准品的储备液，再以甲醇为溶剂配制一系列浓度不同的混合标准样品。每种目标化合物各取8个点，其浓度范围(μg/L)分别为：1-羟基萘(1.96~125.25)、2-羟基萘(2.39~153)、2-羟基芴(6.34~405.6)、2-，3-，4-羟基菲(2.34~150)，9-羟基菲(2.52~161.25)、1-羟基芘(2.23~143)、6-羟基䓛(1.82~116.25)和3-羟基苯并(a)芘(1.23~78.25)。

1.3 尿样收集

采集广东省某中学学生晨尿，主要用于分析方法的验证。

1.4 实验方法 1.4.1 样品预处理

按文献〔3〕进行尿样预处理。

1.4.2 色谱条件

采用甲醇-水梯度洗脱。进样量为20 μl; 流速0.6 ml/min; 柱温40 ℃。流动相切换程序：0~5 min，甲醇60%;5~14 min，甲醇60%~78%;14~21 min，甲醇78%~85%;21~30 min，甲醇85%~100%;30~35 min，甲醇100%;35~39 min，甲醇60%~100%;3 945 min，甲醇60%。荧光(激发波长/发射波长，Ex/Em)切换的时间程序：0 min，Ex/Em=227 nm/355 nm; 16 min, Ex/Em=272 nm/336 nm; 19.5 min, Ex/Em=254 nm/369 nm; 23 min, Ex/Em=239 nm/392 nm; 26 min, Ex/Em=269 nm/392 nm; 28 min, Ex/Em=263 nm/439 nm。

2 结果 2.1 各OH-PAHs荧光条件的优化

对于同一多环芳烃化合物，其不同羟基取代异构体，在最佳荧光检测条件下仍有一定差别。10种OH-PAHs进行荧光条件优化的结果分别为(Ex/Em，nm):1-羟基萘(230/358)、2-羟基萘(227/355)、2-羟基芴(272/336)、2-羟基菲(254/369)、3-羟基菲(250/358)、9-羟基菲(284/383)、4-羟基菲246/371)、1-羟基芘(239/392)、6-羟基䓛(269/392)和3-羟基苯并(a)芘(263/439)。

2.2 HPLC流动相条件的优化

分别选择甲醇-水、乙腈-水以及甲醇-乙腈-水等流动相体系，通过梯度洗脱调整流动相溶剂之间的极性、流速，并分别采用Phenomenex Prodisy ODS (2)、Zorbax Eclipse plus C18, Discovery RP-amide C16等不同填充材料的反相色谱柱进行对比，确定液相色谱分析条件。10种OH-PAHs的出峰时间分别为：2-羟基萘13.5 min; 1-羟基萘14.6 min; 2-羟基芴18.8 min; 2+3-羟基菲20 min; 9-羟基菲20.9 min; 4-羟基菲21.4 min; 1-羟基芘24.4 min; 6-羟基䓛27.1 min; 3-羟基苯并(a)芘(31.1min); 其中2-羟基菲和3-羟基菲仍无法得到完全基线分离(图 1)。

从目前文献报道看，只有GC-MS可将不同羟基取代位的菲进行完全基线分离，但该方法需要采用衍生化^〔7〕，且对样品的净化处理要求较高，因此，国际上通常采用HPLC进行分析。利用HPLC进行分析，大多数文献报道中2-，3-羟基菲属共溢出峰^〔8〕，而在本文中这2个化合物的分离已得到一定程度改善。综合各方面因素，本试验最终选择使用Phenomenex Prodisy ODS (2)分析柱。

2.3 分析方法的质量控制 2.3.1 标准曲线和检测限

标样由低浓度到高浓度依次连续进样3次，取其峰面积的平均值，以峰面积为横坐标，以目标化合物的质量(ng)为纵坐标绘制标准曲线。10种OH-PAHs的标准方程分别为：1-羟基萘Y=7.259X+3.463;2-羟基萘Y=0.172X+0.393;2-羟基芴Y=0.29X+0.129;2-羟基菲Y=0.101X+0.202;3-羟基菲Y=0.067X-0.028;4-羟基菲Y=0.128X+0.138;9-羟基菲Y=0.36X+0.204;1-羟基芘Y=0.103X+0.667;6-羟基䓛 Y=0.08X-0.453;3-羟基苯并(a)芘Y=0.242X+0.002。其R²均在0.999以上。10种OH-PAHs在给定的浓度范围内呈良好的线性关系。

将标样稀释且多次进样，直至信噪比(S/N)到3左右，得出10种OH-PAHs的仪器检出限(LOD)。除3-羟基苯并(a)芘为1.35 μg/L外，其余OH-PAHs的检测限在0.23~0.93 μg/L。

2.3.2 回收率

采用基质加标测定各目标化合物的回收率。取3组尿样，每组6个平行样品。除一组为空白尿样外，其余2组分别加入高浓度混合标样(31~108.2 ng)和低浓度混合标样(7~24.3 ng)。尿样的前处理过程和仪器分析条件均为前述的优化条件。每一样品均连续进样2次，取测定结果的平均值。除3-羟基苯并(a)芘外，9种OH-PAHs的回收率为75%~98%。虽然3-羟基苯并(a)芘的回收率较低(66%)，但与国外文献报道基本一致^〔9〕。

2.3.3 精密度

取2组尿样，每组6个平行样品，分别加入高浓度标样和低浓度标样。在同一天内用相同的前处理过程和仪器分析条件测定，每个连续6次进样，计算日内精密度。在以后的30 d内选取6 d对上述样品进行仪器分析，确定日间精密度。其中日内相对标准偏差(RSD)范围为1.5%~6.2%;日间RSD范围为1.3%~10.2%。各个目标化合物的日内、日间精密度均良好。

2.4 实际样品的分析

应用上述方法对21名中学男生尿样进行测定。共检测出2-羟基萘、2-羟基芴、2-羟基菲、3-羟基菲、4-羟基菲、9-羟基菲、1-羟基芘7种OH-PAHs。其中4-羟基菲检出率为41%，其他6种化合物检出率为100%。7种目标化合物的含量范围、中值及平均值分别为(μmol/mol肌酐)：2-羟基萘0.58~14.95，3.62，4.27;2-羟基芴0.68~6.17;1.55，1.74;2+3羟基菲0.09~0.69，0.23，0.25;4-羟基菲0~0.13，0，0.02;9-羟基菲0.19~4.94，0.45，0.72;1-羟基芘0.06~0.58;0.18，0.22。

3 小结

本研究建立了检测10种OH-PAHs的高效液相色谱-荧光检测分析方法，可同时测定尿样中1-，2-羟基萘、2-羟基芴、2-，3-，4-，9-羟基菲、1-羟基芘、6-羟基䓛和3-羟基苯并(a)芘等10种OH-PAHs。该方法具有较高的灵敏度、精密度和较好的重复性、回收率，可用于PAHs在人体内暴露的生物监测。