中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (4): 419-421   PDF    
引用本文
何迎春, 田道法, 卢芳国, 江洁琼, 贺安意. 益气解毒方对转基因小鼠上皮细胞及基因影响[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(4): 419-421.
HE Ying-chun, TIAN Dao-fa, LU Fang-guo, et al. Effects of Yiqijiedu formula on cell proliferation and genes expressive levels of epithelia in mice[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(4): 419-421.
益气解毒方对转基因小鼠上皮细胞及基因影响
何迎春, 田道法, 卢芳国, 江洁琼, 贺安意     
湖南中医药大学中西医结合学院, 长沙 410007
收稿日期: 2008-08-12
基金项目: 国家自然科学基金(30672738, 30572408);湖南省杰出青年基金(03JJY1006);湖南省科技厅国际合作项目(06WK3016);湖南省教育厅优秀青年基金(06B070)和一般项目(07C473)
作者简介: 何迎春(1972-), 女, 湖南宁乡人, 副教授, 博士后, 主要从事鼻咽癌的防治研究。
摘要: 目的 研究益气解毒方对TgN (p53mt-LMP1)/HT转基因小鼠的鼻腔和鼻咽粘膜上皮细胞增殖及肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)和p16基因表达的影响。 方法 苏木素-伊红(H-E)染色法观察小鼠鼻腔和鼻咽粘膜上皮细胞增殖特征; 免疫组织化学染色法检测小鼠鼻腔和鼻咽粘膜上皮细胞TRAF2、p16基因的表达水平, 并采用蛋白印迹(Western blot)对基因表达进行验证。 结果 与TgN (p53mt-LMP1)/HT小鼠诱癌生理盐水对照组(TIC组)比较, TgN (p53mt-LMP1)/HT小鼠诱癌益气解毒方干预组(TIM组鼻腔和鼻咽粘膜上皮增生不明显, 癌前病变率显著下降(P < 0.01);其TRAF2基因表达水平(TIC组、TIM组鼻腔的分别为129.45±9.53和160.96±11.04, 鼻咽的分别为126.38±12.69和160.88±6.84)显著降低(P < 0.01);p16基因表达水平(TIC组、TIM组鼻腔的分别为157.21±10.44和131.72±10.06, 鼻咽的分别为155.41±11.77和132.63±10.22)显著增高(P < 0.01)。TIM组的TRAF2和p16基因表达水平接近野生型C57BL/6J小鼠对照组(鼻腔和鼻咽的TRAF2基因表达水平分别为165.07±10.58和164.39±7.88, p16基因表达水平分别为129.62±12.16和129.12±11.67), 差异无统计学意义。 结论 中药益气解毒方可阻逆二亚硝基哌嗪(DNP)对TgN (p53mt-LMP1)/HT小鼠鼻腔和鼻咽粘膜上皮细胞异常增殖的诱导效应, 其阻逆作用的发挥与下调TRAF2基因表达和上调p16基因表达密切相关。
关键词： 癌前病变     益气解毒方     肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)     p16    
Effects of Yiqijiedu formula on cell proliferation and genes expressive levels of epithelia in mice
HE Ying-chun, TIAN Dao-fa, LU Fang-guo, et al     
Faculty of Integrative Medicine, Traditional Chinese Medicine University of Hunan, Changsha 41007, China
Abstract: Objective To investigate the effects of Yiqijiedu formula on cell proliferation of nasal and nasopharyngeal epithelia and the expressive levels of TRAF2 and p16 in TgN (p53mt-LMP1)/HT mice. Methods The cell proliferative characteristics of nasalmucosa and nasopharyngeal epithelia was evaluated by H-E staining procedures and the expressive levels of TRAF2 and p16 genes were assayed by immunohis to chemical methods.At the same time, the genes expressive levels were also identified by western blot. Results Compared with tho se of TgN (p53mt-LMP1)/HT mice of normal saline (NS) group (TIC group), hyperplasia of nasal and/or nasopharyngeal epithelia was not obvious in TgN (p53mt-LMP1)/HT cancerous lesion inducing mice with Yiqijiedu fromula (TMI group) and the occurring rate of precancerous lesions in nasal and/or nasopharyngeal epithelia was reduced significantly (P < 0.01).The TRAF2 expressive levels (129.45±9.53, 160.96±11.04 of nasal cavity epithelia of TIC group, and TIM group; 126.36±12.69, 160.88±6.84 in naso pharygeal epithelia) were decreased (P < 0.01) and p16 expressive levels (157.21±10.44, 131.72±10.06 in nasal epithelia of TIC and TIM group; 155.41±11.77, 132.63±10.22 in nasopharyngeal epithelia of TIC and TIM group) were increased markedly (P < 0.01).TRAF2 and p16 expressive levels were similar to those of C57 BL/6J wild-type mice (TRAF2 gene: 165.07±10.58 in nasal epithelia, 164.39±7.88 in naso pharygeal epithelia; p16 gene:129.62±12.16 in nasal epithelia and 129.12±11.67 in nasopharygeal epithelia) with no significant differece. Conclusion The effects of N, N'-dinitrosopipera-zine (DNP) on nasal/naso pharyngeal epithelial abnormal proliferation of TgN (p53mt-LMP)/HT mice can be inhibited by Yiqijiedu formula herbal medicine.The effects of Yiqijiedu fromula is closely related with TRAF2 gene down regulation expression and p16 gene expression upregulation in nasal/naso pharyngeal epithelia of TgN (p53mt-LMP1)/Ht mice.
Key words: precancerous lesions     Yiqijiedu formula     TRAF2     p16    

鼻咽癌(NPC)是我国南方常见的头颈部恶性肿瘤之一，其治疗效果尚不理想，总的5年生存率在50%~60%左右。田道法教授通过一系列的临床与实验研究，提出鼻咽癌的中医病机乃“气虚染毒”之说; 他还研制出益气解毒颗粒，并通过大量临床与实验研究，证实其不仅对Epstein-Barr (EB)病毒具有很强的抑制作用〔1〕，亦能通过抑制细胞端粒酶的激活而阻断二亚硝基哌嗪(DNP)诱导大鼠鼻咽癌变和人胚鼻咽上皮细胞转化〔2, 3〕。为了探讨益气解毒方对转基因小鼠鼻腔/鼻咽癌前病变的干预效应及可能机制，本研究利用前期工作中所制备的鼻腔/鼻咽癌前病变小鼠模型-转外源性人突变型p53基因(p53mt)和EB病毒潜伏膜蛋自1基因(LMP1)小鼠(TgN (p53mt-LMP1)/HT小鼠)后代〔4, 5〕, 观察益气解毒方干预后的小鼠鼻腔和鼻咽粘膜上皮细胞增殖特性及TRAF2和p16基因的表达水平。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

20只G4代5月龄健康TgN (p53mt-LMP1)/HT小鼠(本课题组制备，中科动管会第001号)雌雄各半，体重为(24.0±1.3) g〔4, 5〕。10只同龄野生型健康C57 BL/6J小鼠(中国医学科学院实验动物研究所，SCXK京2004-0001)，雌雄各半。小鼠自然饲养于IVC独立送风笼具中。

1.1.2 主要试剂

小鼠抗人-p16单克隆抗体(美国Santa Cruz公司); 兔抗人肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)多克隆抗体和免疫组化链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(SABC)试剂盒(武汉博士德生物公司); 抑肽酶(德国Boe-hringer公司); 亮抑肽酶、胃蛋白酶抑制剂、兔抗鼠IgG (美国KPL公司); 聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国Invitrogen公司); 增强型辣根过氧化物酶(HRP)-3, 3′-二氨基联苯胺(DAB)显色液(北京TIANGEN BIOTECH公司)。

1.1.3 药物及其制备

益气解毒方(黄芪、黄连、党参、天花粉、茯苓、白花蛇舌草等中草药)(湖南中医药大学附属第一医院)按常规方法煎药，浓缩成含生药860 g/L，抽滤除菌4 ℃保存备用。

1.2 方法 1.2.1 动物分组及化学加强诱癌处理

TgN (p53mt-LMPI)/HT小鼠按随机数字表法分为2组，每组10只，即TgN (p53mt-LMPI)/HT小鼠诱癌益气解毒方干预组(TIM)和TgN (p53mt-LMP1)/HT小鼠诱癌生理盐水对照组(TIC)，同时以野生型C57BL/6J小鼠作为空白对照组(CC)，共3组。TIM、TIC组小鼠分别于前肢腋窝皮下注射2, 4-二硝基苯酚(DNP)40 mg/(kg·bw)，每周2次，共32次; CC组小鼠分别于同部位皮下注射等体积生理盐水。同时给TIM组小鼠灌胃益气解毒方药液〔按人与动物及各类动物间药物剂量的换算方法计算中药用药量，给药剂量为12.91 g/(kg·bw)〕，每天1次，持续16周，与诱癌同时进行，给TIC组和CC组小鼠灌胃等体积生理盐水。

1.2.2 标本采集及处理

诱癌处理完成后，分别取动物鼻腔和鼻咽粘膜组织标本。每份标本分成2部分，一半用40 g/L多聚甲醛固定24 h以上，然后行常规石蜡包埋切片，片厚4 μm，用于上皮细胞增殖特性观察; 另一半标本用灭菌超纯蒸馏水洗净其表面残血，滤纸吸干，放入-80 ℃冻存，用于蛋白印迹检测。

1.2.3 鼻腔和鼻咽粘膜上皮细胞增殖特性观察

常规石蜡包埋切片行苏木素-伊红(HE)染色，由病理医师对上皮细胞增殖特性进行鉴别。根据粘膜上皮细胞病变程度，参考文献〔6, 7〕，区分为正常粘膜、单纯性增生、非典型性增生(癌前病变)、癌变4个等级。

1.2.4 TRAF2和p16基因表达水平的免疫组织化学染色法检测

采用SABC法，严格按照试剂盒说明书进行操作。以磷酸盐缓冲液(PBS)置换抗体作为阴性对照，已知的阳性病理组织作为阳性对照。参照文献〔5〕进行定量分析。

1.2.5 TRAF2和p16基因表达的Western blot验证

分别提取各组小鼠鼻咽和鼻腔粘膜蛋白质，参照文献〔8〕进行。

1.3 统计分析

采用SPSS14.0统计软件对计量资料进行单因素方差分析，并进行组间的多重比较; 对计数资料进行χ2检验或Fisher确切概率法分析。

2 结果 2.1 益气解毒方对小鼠鼻咽和鼻腔粘膜上皮细胞增殖的影响

TIM组中多数小鼠的鼻咽、鼻腔粘膜未见明显病理改变，少数动物出现轻度慢性炎症表现以及上皮细胞的轻-中度非典型性增生，癌前病变率仅为10.0%。TIC组小鼠鼻腔粘膜出现中性粒细胞浸润，上皮细胞增生且排列无序，细胞中度非典型性变; 鼻咽粘膜表现为中性粒细胞浸润，上皮有中度非典型增生及灶性鳞状化生; 该组小鼠鼻咽和/或鼻腔粘膜癌前病变率高达90.0%。CC组小鼠的鼻咽、鼻腔粘膜无明显病变，癌前病变率为0。TIC组癌前病变率最高，与TIM组、CC组比较，差异有统计学意义(χ2=21.052，P=0.000);TIM组和CC组比较，差异无统计学意义。

2.2 益气解毒方对小鼠鼻腔和鼻咽粘膜上皮细胞TRAF2基因表达的影响(表 1)
表 1 小鼠鼻腔和鼻咽粘膜上皮TRAF2基因表达水平(x±s)

鼻咽/鼻腔表现为癌前病变的TIC组小鼠，其鼻咽或(和)鼻腔粘膜组织的TRAF2基因在细胞质中大量表达，大片细胞质呈现棕黄色。与TIC组小鼠比较，TIM组小鼠TRAF2基因表达活性显著降低，差异有统计学意义(P < 0.01)。TIM组和CC组的TRAF2基因只在小范围的细胞质内极少量表达，两者表达活性差异无统计学意义。结果表明TIC组小鼠中4只出现鼻腔癌前病变，5只出现鼻咽癌前病变，取癌前病变小鼠组织进行检测，每片观察2个视野，故TIC组样本量鼻腔的为8，鼻咽的为10;TIM组1只小鼠表现鼻咽癌前病变，9只正常，鼻咽样本量为18，其余组别各部位均未出现癌前病变，样本量均为20。

2.3 益气解毒方对小鼠鼻腔和鼻咽粘膜上皮细胞p16基因表达的影响(表 2)
表 2 各组小鼠鼻腔和鼻咽粘膜上皮p16基因表达水平(x±s)

鼻咽和鼻腔表现为癌前病变的TIC组小鼠的鼻咽或(和)鼻腔粘膜组织的p16基因在细胞核与细胞质中较少表达，而在TIM和CC组小鼠正常的鼻咽、鼻腔上皮组织中p16基因大量表达，细胞核染色深，细胞质大面积呈棕黄色。与TIC组比较，TIM组小鼠p16基因表达活性显著升高，差异有统计学意义(P < 0.01);而TIM组和TC组比较，小鼠p16基因表达活性的差异无统计学意义。

2.4 TRAF2和p16基因表达的验证(图 1~4)
注:M:Marker; 1:TIC组标本; 3:CC组标本 图 1 小鼠鼻咽粘膜中TRAF2蛋白质表达的Western blot

注:M:Marker; 1:TIC组标本; 2:TIM组标本; 3:CC组标本。 图 2 小鼠鼻咽粘膜中p16蛋白质表达的Wesrern blot

注:M:Marker; 1:TIC组标本; 2:TIM组标本; 3:CC组标本。 图 3 小鼠鼻咽粘膜中TRAF2蛋白质表达的Wesrern blot

注:M:Marker; 1:TIC组标本; 2:TIM组标本; 3:CC组标本。 图 4 小鼠鼻咽粘膜中p16蛋白质表达的Wesrern blot

TRAF2蛋白和P16蛋白的分子量分别约为56和16 kDa。通过Westem blot分析可知，在相应分子量的Marker条带所处水平附近，各类组织标本均有相应条带出现，说明各组小鼠的鼻腔、鼻咽组织中，TRAF2蛋白和P16蛋白均有相应水平的表达活性。并且TRAF2蛋白条带亮度按TIC组、TIM组和CC组顺序依次降低，TIC组的TRAF2蛋白亮度明显高于其他2组; 而p16蛋白条带亮度按TIC组、TIM组和CC组顺序依次递增，TIC组的P16蛋白条带亮度显著低于其他2组，应证了上述各项指标免疫组化检测结果的可靠性。

3 讨论

中药益气解毒方对鼻咽癌前病变患者的局部病变有较明显的阻断和逆转作用，在体外可下调靶细胞的端粒酶活性〔9〕，抑制肿瘤细胞增殖速度、成瘤能力，同时提高细胞分化能力，降低肿瘤的侵袭力〔10-12〕。本实验中，中药益气解毒方可明显阻逆TgN (p53mt-LMP1)转基因鼻咽/鼻腔癌前病变模型小鼠的鼻咽和鼻腔粘膜癌前病变，使鼻咽和鼻腔粘膜上皮生物学表型接近野生对照鼠。

TRAF2蛋白作为一种衔接蛋白，能与一些细胞表面受体直接作用，介导下游信号级联反应，调节细胞生存/死亡活性平衡。当活性上调后，即具有抗凋亡效应。p16基因是一种细胞周期素依赖性激酶(CDK)抑制因子，其编码的p16蛋白与细胞周期素D竞争同CDK4或CDK6结合，并抑制这2种酶的活性，阻断细胞周期进程而抑制肿瘤细胞生长。当P16蛋白失活时。使细胞失去了对CDK的负性调控作用，使得过多细胞越过G1/S检测点而加速增殖。本研究中，与转基因阳性小鼠生理盐水对照组比较，转基因阳性小鼠益气解毒方干预组的鼻咽和鼻腔粘膜上皮细胞中TRAF2表达活性明显下调，p16基因表达活性明显上调，接近正常水平，与正常野生小鼠比较差异无统计学意义。Western blot结果与免疫组织化学染色法检测一致，进一步验证了TRAF2基因和p16基因在各组小鼠鼻咽和鼻腔中的表达趋势。提示中药益气解毒方通过降低TRAF2基因表达活性，维持P16蛋白水平，使细胞周期调控得以恢复至正常，保证细胞周期趋向正常化，抑制靶器官组织的细胞增殖和向恶性转化〔13, 14〕，以达到阻抑鼻咽/鼻腔癌前病变的治疗效果。

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