亚洲牛带绦虫(Taenia saginata asiatic)是一种介于猪带绦虫和牛带绦虫之间的人体带绦虫，其成虫特征几乎和牛带绦虫一致，但其中间宿主主要是猪，人因生食猪肝等内脏而感染^〔1-3〕。近年来，本课题组在亚洲牛带绦虫和牛带绦虫的流行病学、分类学、生态学、发育生物学、组织病理学和免疫学等传统寄生虫学领域进行了研究，摸清了2种带牛绦虫在我国西部省区的分布情况和主要传播方式^{〔4, 5〕}。2006年，在前期研究的基础上开启了对亚洲牛带绦虫功能基因组学的研究^〔6〕。本研究通过筛选亚洲牛带绦虫成虫cDNA质粒文库, 寻找、识别出亚洲牛带绦虫CRISP (TaCRISP)新基因, 将其编码区克隆到原核表达质粒pET-30a (+)中, 并在大肠埃希菌BL-21/DE3中表达出融合蛋白, 为进一步研究其功能提供基础依据。

虫体标本采自亚洲牛带绦虫流行区贵州省都匀市米秀乡，亚洲牛带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建和标签(EST)测序及Unigene分析与上海联合基因有限公司合作完成。编码亚洲牛带绦虫CRISP基因文库质粒编号为Ta HC10-A11，接收登录号为EF420485。原核表达质粒pET-30a (+)和大肠埃希菌BL-21/DE3由中山医学院病原生物学实验室保存。

Ex Taq酶(含dNTP)，NedⅠ，XhoⅠ，T4 DNA连接酶，DNA标准(DL 15，000;DL 2，000)(大连宝生物工程公司); 异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(美国Promega公司); Ni-IDA Agarose (cat No：69670)(美国Novagen公司); 蛋白分子量标准(立陶宛MBI公司); DNA凝胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒(北京赛百盛基因公司)。

基因扩增引物和重组质粒DNA测序由Introvigen上海生物技术有限公司合成。

利用开放阅读框(ORF Finder)探寻器确定其完整编码序列并显示其编码的氨基酸序列。利用蛋白分析专家系统服务器ExPASy Proteomics Server (http://ca.expasy.org/)所提供的蛋白质在线分析工具，如protparam (http://au.expasy.org/tools/protparam.html)预测氨基酸序列的分子量、等电点、稳定性指数等理化性质; InterPro Scan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)和MotifScan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)预测氨基酸序列中的功能域。

根据已获得的CRISP编码序列，利用DNAClub和PCRdesign去除信号肽设计引物。上游引物：AATCATATGGAAAGACCAACAGAGGCAGAACGC，带NedⅠ酶切位点; 下游引物：AGCCTCGAGCTGAACAAGTAGGTAAACGATGAG，带Xho Ⅰ酶切位点。以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中CRISP基因的克隆质粒为模版，94 ℃预变性5 min后，热循环参数为94 ℃ 1 min，61 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳回收。

将PCR产物和原核表达质粒pET-30a (+)经NedⅠ，Xho Ⅰ双酶切后回收，连接，转化大肠埃希菌BL-21/DE3感受态细胞，卡那霉素筛选阳性克隆。对阳性克隆提取质粒进行PCR，双酶切和测序鉴定。

取50 μl培养过夜的阳性克隆菌液，加入含有卡那霉素的5 ml LB培养基中(菌液/培养基为1/100)，37 ℃ 250 r/min振摇至A 600为0.4~0.6时，加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)至终浓度1 mmol/L，诱导表达5 h。离心收集菌体，在沉淀中加入100 μl上样缓冲液，煮沸5~10 min，13 000 r离心，1 min取上清10 μl进行十二烷基磺酸钠聚丙烯胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析。

按照上述方法对阳性克隆进行大量诱导表达，离心收集菌体，按每g菌体加入4 ml结合缓冲液重悬菌体，冰上放置30 min后冰上超声裂解(功率150 W，持续1 s，停2 s，共15 min)，4 ℃ 13 000 r/min离心20 min，收集上清，取30 μl加入10 μl SDS-PAGE上样缓冲液处理样品，12%SDS-PAGE，考马斯亮兰R 250染色。

从BLASTX分析结果看，该基因与GenBank中殖孔绦虫(登录号为AAT74668)(CRISP)同源基因的一致性为38%，相似性为54%。比对结果，该克隆基因的5′端序列长于中殖孔绦虫CRISP完整编码序列, 其最大的ORF就是其完整的编码区，该基因全长1 090 bp, 编码区为153~870，编码239个氨基酸，在5′端和3′端都有非翻译区，1aa-16aa为信号肽, 方框内是该蛋白CRISP-1和CRISP-2功能结构域的所在位置, 为421:YYLQMVWGN; 541:YLLTCAYTPPG，所以推测为亚洲牛带绦虫成虫CRISP的全长基因序列。

亚洲牛带绦虫CRISP的理论分子量和等电点分别是26 973.8和5.96。假设形成3对二硫键时，280 nm处的摩尔消光系数为47 620 mol/cm, 0.1%浓度(1 g/L)的Abs为1.765;假设二硫键全部打开时，280 nm处的摩尔消光系数为46 870 mol/cm 0.1%浓度(1 g/L)的Abs为1.738。当成熟肽N端的一个氨基酸为蛋氨酸时，在哺乳动物网状红细胞体外表达的半衰期为30 h, 在酵母和大肠埃希菌中体内表达的半衰期分别>20和10 h。在溶液中的不稳定指数为37.92, 低于域值40，在溶液中性质稳定。

通过蛋白分析专家系统服务器ExPASy Proteomics Server (http://ca.expasy.org/)所提供的蛋白质在线分析该基因具分泌型信号肽，1aa-16aa为信号肽位置。

扫描一级结构中包含的结构和功能域特征序列该氨基酸序列中含有4个V5TPLIKE催化位点motif, 并含有CRISP和SCP的功能域，推测其可能具有半胱氨酸分泌蛋白功能。

图 1

注:M:DNA标准(DL2000);1:CR ISP的PCR产物; 2:pET-30a (+)-Ta CR ISP的双酶切; 3:pET-30a (+)-Ta CRISP重组质粒。 图 1 组质粒的PCR及双酶切鉴定图

将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。第1泳道是PCR产物，第2泳道是双酶切鉴定结果，在750~500 bp之间有一清晰的条带，与目的基因(719 bp)的大小基本相符，证明重组质粒构建成功。注：M：DNA标准(DL2000);1：CRISP的PCR产物; 2：pET-30a (+)-Ta CRISP的双酶切; 3：pET-30a (+)-Ta CRISP重组质粒。

图 2

注:M:蛋白标准; 1:pET-30a (+)质粒未加IPTG诱导; 2:pET-30a (+)质粒加IPTG诱导; 3:pET-30 a (+)-Ta CR ISP重组质粒未加IPTG诱导; 4:pET-30a (+)-Ta CR ISP重组质粒加IPTG诱导; 5: pET-30 a (+)-Ta CR ISP重组质粒沉淀; 6:pET-30 a (+)-Ta NO-MO1重组质粒上清。 图 2 重组质粒pET-30a (+)-CR ISP在大肠埃希菌BL-21/DE3的SDS-PAGE电泳分析

将构建好的重组质粒转化到E.coli BL-21/DE3中表达，SDS-PAGE电泳分析结果第4，5泳道所示，大约在30 kD左右处出现表达条带，与目的蛋白分子量基本相符。

寄生虫的半胱氨酸蛋白酶(CRISP)是目前的研究热点，对它的研究不仅揭开了寄生虫与宿主相互作用机制，也为寄生虫的诊断和防治提供了新的思路^{〔7, 8〕}。本研究通过BLASTX从亚洲牛带绦虫cDNA文库中识别出了一个编码CRISP的全长基因，并通过生物信息学的方法对其所编码蛋白的结构和功能进行预测，该蛋白为分泌型蛋白，具分泌信号肽，并具有半胱氨酸蛋白所特有的SCP、CRISP-1和CRISP-2结构功能域，该基因与GenBank中殖孔绦虫(登录号为AAT74668) CRISP同源基因的一致性为38%，相似性为54%，所以推测为半胱氨酸蛋白酶(CRISP)^{〔9, 10〕}。

本研究将亚洲牛带绦虫成虫CRISP克隆到原核表达质粒pET-30a (+)中，双酶切及DNA测序结果均表明，pET-30a (+)-Ta CRISP重组质粒构建成功。在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。SDS-PAGE结果表明，该蛋白在全菌和沉淀中都有表达，但在上清中未见表达，说明CRISP是包涵体蛋白，在今后的实验中可以通过破包涵体得到纯化蛋白。本研究为进一步研究亚洲牛带绦虫CRISP的生物功能及其该蛋白在诊断、药物及疫苗研究中的应用前景提供了线索。