HgCl₂是重要的环境和工业污染物，广泛应用于农药、染料、电池、杀菌剂、防腐剂等的生产，与人类的生活环境密切相关^〔1〕。HgCl₂主要的代谢器官和毒作用靶器官是肝脏和肾脏，通过多种途径对机体产生毒性作用，严重威胁人类健康^〔2〕。李荔等用氯化汞染毒小鼠，观察到受氯化汞染毒小鼠的肝脏，无论显微结构及超微结构均表现出一系列明显的病理学变化^〔3〕。本研究通过四甲基偶氮噻唑蓝法(MTT)、单细胞凝胶电泳(SCGE)、流式细胞术(FCM)、免疫细胞化学方法，在细胞水平和分子水平上探讨HgCl₂对HL-7702细胞增殖、DNA损伤、细胞周期等生物学效应的影响。

HL-7702细胞株(中国科学院上海细胞生物研究所); 氯化汞(北京化工厂); MTT (美国Amerco公司); 二甲基亚砜(DMSO)(沈阳市试剂五厂); 低熔点琼脂糖(LMA)(美国Promega公司); 正常熔点琼脂糖(NMA)(宝泰龙生物有限公司); 溴化乙啶(EB)和碘化丙啶(PI)(美国Sigma公司); RPMI-1640(美国GIBCO公司); 胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所); Rabbit anti-MT (北京博奥生物技术有限公司); 通用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)试剂盒(迈新生物试剂公司)。

将HL-7702细胞于含20%胎牛血清的RPMI-1640培养液，37℃，5% CO₂培养箱培养。每隔2~4 d，0.25%胰蛋白酶消化1~2 min，1 000 r/min离心5 min传代，取对数生长期细胞进行实验。

将HL-7702细胞接种于96孔培养板(2×10⁴个细胞/孔)，37 ℃，5% CO₂的培养箱内培养24 h后染毒。受试物以RPMI-1640培养基为溶剂，HgCl₂设3个剂量组(10，20，30 μmol/L)，RPMI-1640培养液为阴性对照，每组10复孔，同等条件下将细胞分别染毒8，16 h。加MTT (5mg/ml)溶液20 μl，继续培养4 h。小心吸弃上清，加入DMSO 150 μl振荡10 min，用酶标仪在490 nm波长处测定其吸光度(A)值。细胞抑制率(%)=[(对照组A值-实验组A值)/对照组A值]×100%。

将HL-7702细胞接种于6孔培养板(3×105个细胞/孔)，37 ℃，5 % CO₂的培养箱内培养24 h后染毒。受试物以RPMI-1640培养液为溶剂，将HgCl₂设3个剂量组(10，20，30 μmol/L)，RPMI-1640培养液为阴性对照，每组4复孔，同等条件下将细胞分别染毒8，16 h。单细胞凝胶电泳方法参照文献〔4〕，溴乙锭染色，荧光显微镜观察。每个样本计数50个细胞，每一处理组共计数200个细胞，计算DNA损伤率。DNA损伤率(%)=(Ⅰ级+Ⅱ级+Ⅲ级+Ⅳ级核DNA个数)/核DNA总个数×100%。

细胞处理同1.4，每组3复孔。在培养箱内将细胞分别培养8，16 h。收集细胞，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，加Rnase (0.1g/L)100 μl，加PI (含Triton-X-100)100 μl单染37 ℃、30 min避光保存，用流式细胞仪检测细胞周期，用CELLQuest软件收取细胞，每个样品收集1×10⁴个细胞，用ModFit软件分析细胞周期。结果用细胞周期各时相细胞百分数表示。

细胞处理同1.4，每组4个复孔。在培养箱内将细胞培养16 h。按照通用SP试剂盒说明书进行操作。阳性细胞浆(或胞膜、胞核)呈棕黄色染色，10×20倍镜下每张片随机取5个视野，用IPP软件分析，取累积吸光度(IA)平均值。

应用SPSS 10.0统计软件进行分析。SCGE试验结果采用χ²检验进行分析。进行组间均数差异的统计学分析。

表 1

表 1 HgCl2对HL-7702细胞抑制率的影响(x±s, n=10)

表 1 HgCl2对HL-7702细胞抑制率的影响(x±s, n=10)

MTT检测结果表明，不同浓度的HgCl₂作用于HL-7702细胞，染毒时间为8，16 h，每个时间点A值均随着HgCl₂浓度增大而逐渐降低，与对照组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)。HgCl₂对HL-7702细胞的抑制率随着HgCl₂浓度增大而逐渐升高。HgCl₂对HL-7702细胞的抑制率随染毒时间延长而增高。

表 2

表 2 HgCl2对HL-7702细胞DNA损伤率的影响

表 2 HgCl2对HL-7702细胞DNA损伤率的影响

SCGE检测结果表明，不同浓度的HgCl₂作用于HL-7702细胞，染毒时间为8，16 h，每个时间点DNA损伤率均随HgCl₂浓度增大逐渐升高。各剂量组与对照组比较，差异均有统计学意义(P < 0.001)。

表 3

表 3 HgCl2对HL-7702细胞周期各时相影响(x±s, n=3)

表 3 HgCl2对HL-7702细胞周期各时相影响(x±s, n=3)

FCM法检测结果表明，不同浓度的HgCl₂作用于HL-7702细胞8，16 h，G₀/G₁期细胞百分数随HgCl₂浓度增大而升高，20，30 μmol/L组与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。

表 4

表 4 HgCl2作用于HL-7702细胞16h细胞表达MT的影响(x±s, n=3)

表 4 HgCl2作用于HL-7702细胞16h细胞表达MT的影响(x±s, n=3)

免疫细胞化学方法检测结查表明，不同浓度的HgCl₂作用于HL-7702细胞16 h，MT的表达随HgCl₂浓度增大而升高，10，20，30 μmol/L组较对照组比较，差异均有统计学意义(P < 0.01)。

HgCl₂能够对HL-7702细胞产生细胞毒作用。MTT检测结果提示，氯化汞对琥珀酸脱氢酶活性的抑制可能是因为氯化汞与琥珀酸脱氢酶二硫键高亲合，使-S-基活性中心部位被封闭，酶的空间构象发生变化而失活^{〔5, 6〕}。当含有巯基的酶被HgCl₂消耗，细胞会启动一系列自我保护机制。本研究中，不同浓度的HgCl₂作用于HL-7702细胞16 h，MT的表达随HgCl₂浓度增大而升高，10，20，30 μmol/L组与对照组比较差异均有统计学意义(P < 0.01)。提示HgCl₂作用HL-7702细胞后，细胞启动了MT保护机制，肝细胞中MT被大量诱导表达。

大量实验证明，氯化汞具有明显的DNA断裂作用，体外实验证实，氯化汞在10 mmol/L可诱发非程序DNA合成明显增高。汞具有致突变作用，可以引起染色体畸变^{〔9, 11〕}。因此，本研究采用FCM法检测不同浓度的HgCl₂分别染毒HL-7702细胞8，16 h各时相细胞百分数。结果表明，无论是8 h还是16 h，G₀/G₁期细胞百分数均随HgCl₂浓度增大而升高，20，30 μmol/L组与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。提示HgCl₂可以将细胞阻滞在G₀/G₁期，导致进入S期的细胞数目减少，从而抑制DNA的合成。