2009, Vol. 25
染料木黄酮(Genistein)作为大豆异黄酮的主要成分，它的空间结构与雌激素相似。动物实验和人群实验显示, 它能够发挥类雌激素作用, 提高骨密度，增加骨矿含量，预防骨质疏松，而无雌激素的副作用〔1, 2〕。我国大豆资源非常丰富，因此，开展大豆异黄酮抗骨质疏松的研究，阐明其作用的分子生物学机制，为其应用提供科学根据具有重要意义。本实验直接采用大豆异黄酮的主要成分染料木黄酮干预分离培养的人成骨细胞，从细胞层面揭示染料木黄酮对人成骨细胞增殖和分化的作用以及剂量效应关系。
1 材料与方法 1.1 人成骨细胞来源采用人松质骨，选取中山大学附属第一医院截肢患者手部腕骨，术前证实无代谢性骨病，未服激素类等药物。
1.2 成骨细胞(hOB)分离、培养与鉴定采用胰酶-胶原酶顺序消化法获得成骨细胞；倒置相差显微镜观察细胞形态；碱性磷酸酶染色（改良Kaplow氏重氮盐法）；骨钙素测定（骨钙素放免试剂盒）以鉴定成骨细胞，并绘制细胞的生长曲线；确认成骨细胞用于研究。
1.3 四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）细胞增殖实验细胞消化后，用无酚红胎牛血清培养液（DMEM）:F12培养液，〔含15%胎牛血清(FBS)、维生素C (VC)50 μg/ml、青霉素50 g/ml、庆大霉素50 μg/ml〕配成悬液，将细胞浓度调至1×104个/ml，加入96孔培养板，然后移入培养箱培养。待细胞贴壁后，换含受试物培养基，按实验设计分别设二甲基亚砜（DMSO）溶剂对照组，雌二醇（1×10-8 mol/L）阳性对照组，染料木黄酮1×10-9，1×10-8，1×10-7，1×10-6 mol/L等4个剂量组。每组8孔，分别在24，48，72 h取出1板，进行MTT细胞增殖实验。
1.4 成骨细胞碱性磷酸酶活性测定将培养的细胞消化计数后，按每孔2 ml分别加入24孔细胞培养板，分组与培养同上，加入0.1% Triton-X100冻融后，测定细胞碱性磷酸酶活性，用考马斯亮蓝法测定样品中蛋白质含量。
1.5 统计分析采用SPSS 11.0软件进行统计分析。多组间均数比较先采用方差齐性检验, 方差齐者进行单因素方差分析(ANOVA)；相关分析采用Spearman等级相关分析。
2 结果 2.1 人成骨细胞原代培养与鉴定在倒置相差显微镜下观察，成骨细胞呈成纤维细胞样集落生长，中央有卵圆形核，胞浆向外伸展，并伸出突起(图 1)。传代细胞经碱性磷酸酶染色后，细胞胞浆内有红棕色颗粒(图 2), 显示碱性磷酸酶染色阳性；细胞培养液中骨钙素测定结果为阳性。
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图 1 人成骨细胞原代培养第15d (100×) |
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图 2 人成骨细胞碱性磷酸酶染色(400×) |
2.2 成骨细胞生长曲线和倍增时间
培养第2 d，细胞进入对数生长期，第6 d达高峰，为13.50×104个/ml，细胞生长曲线近似S形，呈“滞缓-对数生长-平台”模式；细胞群体倍增时间为62.01 h。
2.3 染料木黄酮对人成骨细胞增殖影响（表 1）
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表 1 染料木黄酮对体外培养人成骨细胞增殖的影响(x±s, n=8) |
从各时间点来看，不同浓度染料木黄酮成骨细胞的增殖影响不同。72 h时，除了1×10-9 mol/L组与对照组比较，差异无统计学意义外（P > 0.05），其余各组MTT吸光度(A)值均高于对照组（P < 0.05），其中染料木黄酮1×10-7 mol/L组A值最高，比对照组高27.8%。以染料木黄酮浓度和MTT吸光度值进行Spearman相关分析。结果显示，染料木黄酮浓度和MTT吸光度(A)值呈正相关（分别r=0.790，0.583，0.509均P < 0.01），表明在各时间点上，随着染料木黄酮浓度升高，MTT吸光度值也逐渐上升。实验各组在48和72 h的吸光度(A)值均较24 h升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。对染料木黄酮干预时间和MTT吸光度(A)值进行Spearman相关分析。结果显示，各组干预时间与A值也呈正相关（分别r=0.800，0.789，0.807，0.855，0.715，0.830，均P < 0.01），呈现时间效应关系。
2.4 染料木黄酮对人成骨细胞碱性磷酸酶活性影响（表 2）|
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表 2 染料木黄酮对人成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响(x±s, n=4) |
从各时间点来看，干预时间24 h时，染料木黄酮各组以及雌激素组与对照组比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）；随着干预时间延长，在48，72 h时，染料木黄酮1×10-7，1×10-6 mol/L及雌激素组碱性磷酸酶活性的差异均有统计学意义（P < 0.05）；对染料木黄酮浓度与碱性磷酸酶活性之间进行Spearman相关分析。结果显示，24，48，72 h各时间点的相关系数（r）分别为0.617，0.907，0.842（均P < 0.05）。提示在各时间点，随着染料木黄酮浓度升高，碱性磷酸酶活性也有逐渐升高趋势。从时间变化来看，干预48和72 h，染料木黄酮1×10-7，1×10-6 mol/L组及雌激素组碱性磷酸酶活性均高于24 h组（P < 0.05）。干预时间与碱性磷酸酶活性之间的Spearman相关分析结果显示，只有染料木黄酮1×10-7和1×10-6 mol/L组具有相关性，相关系数（r）分别为0.738，0.791（分别P=0.023和0.011）。
3 讨论目前，我国有关药物对体外成骨细胞影响的研究多是取材胎鼠或成熟大鼠，而直接取材成人成骨细胞的研究报道不多。这是由于成人成骨细胞较胎鼠的成骨细胞活性低，耐受性差，体外培养不易成活，必须获得足够数量的细胞，才能保持其活性〔3〕。本实验采用胰酶、胶原酶Ⅱ顺序消化法，并在细胞培养液中检测到骨钙素的存在，ALP染色阳性，符合成骨细胞重要生物学特征。
染料木黄酮对体外培养成骨细胞的作用报道较多，由于细胞来源不同、生长发育成熟不同，其结果不尽一致〔4, 5〕。本实验结果显示，在不同时间、不同浓度染料木黄酮对人成骨细胞增殖的影响也不同。Spearman相关分析发现，染料木黄酮刺激成骨细胞增殖的作用呈时间和剂量效应关系。
本研究显示，随着时间的延长，染料木黄酮不同浓度的各组碱性磷酸酶活性都有显著增加，在72 h时，染料木黄酮1×10-6 mol/L组碱性磷酸酶活性最高，与对照组相比升高82.7%。本实验结果也表明，随着染料木黄酮浓度的升高，碱性磷酸酶活性也有逐渐上升的趋势。多数学者认为，雌激素可促进骨形成及骨细胞增殖，增加ALP的合成。这种增强作用呈剂量依赖性，以1×10-8 mol/L浓度作用为明显〔6, 7〕。因此，本实验采用1×10-8 mol/L雌激素来作为阳性对照。结果表明，雌激素在48，72 h都能促进碱性磷酸酶活性升高，与前述相符。染料木黄酮作为弱植物雌激素，其促进碱性磷酸酶活性最高的是在72 h，染料木黄酮1×10-6 mol/L组，此浓度高于雌激素的1×10-8 mol/L，说明染料木黄酮促进碱性磷酸酶的活性弱于雌激素。
本实验直接采用大豆异黄酮的主要成分染料木黄酮干预分离培养的人成骨细胞，在消除种属差异的基础上，从细胞水平进一步证实了染料木黄酮对人成骨细胞的增殖和分化作用，但大豆异黄酮降低骨丢失作用的其他机制还需进一步研究。
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