据世界卫生组织(WHO)报告，结核病目前已跃居为人类头号杀手，而我国肺结核的发病率高居世界第2位。在治疗过程中，由于抗结核药物引起的肝毒性，迫使很多患者停止治疗，从而加重了病情，也增加了疾病传播的可能性。因此，判断抗结核药物的肝毒性对指导临床用药具有重要意义。研究结果表明，肝毒性的一般危险因素有性别、年龄、体重、饮酒、营养不良、疾病的并发症等^〔1-6〕，然而从分子流行病学水平研究肝毒性的报道相对较少。N-乙酰基转移酶-2(N-acetyltransferase-2, NAT2)是一种肝脏药物代谢酶。本文采取巢式病例对照研究(兼有病例对照研究与队列研究两者之优点)，从分子流行病学水平进行NAT2基因型多态性与抗结核药物引起肝毒性的关系探讨，寻找抗结核药物引起肝毒性的易感基因。

于2006年1~12月，在山东省某市级胸科医院确诊的活动性肺结核新发病例中选择年龄≥40岁，汉族，山东人，无肝脏疾病，如病毒性肝炎、酒精性肝病等，无大量饮酒习惯，抗结核治疗前肝功能正常，无肾脏疾病，肾功能正常，能保证配合6个月内的肝功能检查。治疗方案为2HRZ/4HR、2HRZS (E)/4HR或间歇疗法。共选择符合条件者187例，彼此之间无血缘关系，其中男性101例，女性86例，年龄40~69岁。

收集队列内每个成员的相关信息，包括年龄、性别、身高、体重、基础丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)等指标；每人采静脉血3 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离血单核淋巴细胞后，裂解细胞，常规酚/氯仿方法提取DNA，置-20 ℃冰箱保存备用。

对队列中每个成员进行常规抗结核治疗，并进行跟踪随访调查，随访6个月，于开始治疗的第15, 30 d，2，4，6个月末进行实验室检查(包括血象、AST、ALT、碱性磷酸酶胆红素及尿酸等生化检查)。当患者有肝炎症状或血清转氨酶高于基线值则适当增加临床及实验室检查次数。抗结核药物引起肝毒性标准见参考文献〔7〕。观察抗结核药物引起肝中毒的病例数，出现肝中毒的患者36例组成病例组，在未出现肝中毒的成员中抽取36例组成对照组，其与肝中毒者年龄、性别、身高、体重、基础ALT、AST、TBLL等指标尽可能地相近，即配对。

对肝中毒病例组36例和其配对对照组36例进行聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)，检测NAT2基因多态性。引物序列为5′-GACATTGAAGCATATTTTGAAAG-3′和5′-GATGAAAGTATTTGA TGT TTAGG-3′；25 μl PCR反应体系：10×Buffer 2.5 μl, dNTP 200 μmol/L, 引物各20 pmol, MgCl₂ 115 mmol/L, 基因组DNA 80 ng, TaqDNA聚合酶2.5 U；反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 1.5 min, 35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物长度为999 bp, 分别与5 U的KpnI、BamHⅠ限制性内切酶37 ℃反应6 h，Taq Ⅰ限制性内切酶65 ℃反应5 h；1.5%琼脂糖凝胶电泳分析判断其基因型。4种NAT2等位基因包括野生型等位基因Wt、突变型等位基因M1、M2和M3，并按携带野生型等位基因的个体(含WT基因)表现为快乙酰化者，携带2个突变等位基因的个体(无WT基因)表现为慢乙酰化者的原则分组。

采用SPSS 10.0软件进行统计分析。定量资料先进行正态性检验、方差齐性检验以判断样本资料分布是否正态分布且方差齐。符合条件的指标2组均数比较采用t检验，方差不齐用较正t′检验(Satterthwaite法)。定性资料采用1：1配对病例对照的χ²检验，根据条件(b+c＜40)用McNemar校正公式计算，并计算比值比(OR)及其95%CI。

经随访调查，在常规抗结核治疗期间，队列人群187例中有1例由于其他严重不良反应中断治疗，1例失访，余下185例中，因抗结核药引起的肝中毒患者有36例，占19.46%，未引起肝中毒的有149例，占80.54%。经相应的统计学检验，肝中毒组和非肝中毒组随访前的基础特征差异无统计学意义，具有可比性。

187例肺结核患者的血标本用常规酚/氯仿方法提取DNA，结果发现，提取的基因组DNA条带清晰，未见DNA降解。

图 1

注：1-4：PCR产物；M：100 bp Marker。 图 1 PCR产物电泳鉴定图

随访结果中出现肝中毒症状的患者36例(病例组)和与其1：1配对的36例对照组成员的外周血淋巴细胞DNA经扩增后，均产生NAT2基因特定片段，说明NAT2基因均扩增成功。

图 2

注：A：Kpn Ⅰ酶切图:WT/WT基因型(477，522bp)，WT/M1基因型(477，522，999bp)，M1/M1基因型(999bp); B:Taq Ⅰ酶切图:WT/WT基因型(170，226, 244, 359bp)，WT/M2基因型(170, 226, 244, 359, 396bp)，M2/M2基因型(244, 359, 396bp); C:BanH Ⅰ酶切图:WT/WT基因型(146，853bp); WT/M3基因型(146, 853, 999bp); M3/M3(999bp); M:100bp DNA Marker。 图 2 NAT2基因PCR产物酶切电泳图

对36例肝中毒患者及其配对对照组中的36例继续进行了NAT2基因多态性分析，检测发现肝中毒组中快乙酰化者有21例，占58.3%；慢乙酰化者有15例，占41.7%。对照组中快乙酰化者有30例，占83.3%；慢乙酰化者有6例，占16.7%。对照组中NAT2野生基因型占40.5%，杂合基因型占42.8%，突变基因型占16.7%，经吻合度χ2检验，发现其分布在人群中达到Hardy-Weinberg平衡。

表 1

表 1 NAT2基因多态性与抗结核药致肝毒性1：1配对病例对照结果

表 1 NAT2基因多态性与抗结核药致肝毒性1：1配对病例对照结果

结合NAT2基因多态性分析结果与抗核药致肝毒性结果，发现慢乙酰化基因型M1/M1、M1/M2、M1/M3、M2/M2、M2/M3、M3/M3较快乙酰化基因型Wt/Wt、Wt/M1、Wt/M2、Wt/M3经抗结核药物治疗更容易发生肝毒性，故将慢乙酰化基因型作为有暴露，快乙酰化基因型作为无暴露，整理成NAT2基因多态性与抗结核致肝毒性1：1配对病例对照结果分析表。

本次调查发现，病例组和其配对对照组在接受相似的抗结核药方案治疗时肝毒性的发生可能性明显不同。提示遗传因素在其中可能发挥作用，也为寻找其易感基团提供了可能性。NAT2是一个II相代谢酶，催化乙酰基因从乙酰CoA转移到其作用底物上(芳香胺及杂环胺类物质)，在人体对芳香胺类及杂环类物质的活化和(或)灭活以及某些药物的化谢过程中起着重要作用，揭示NAT2基因多态性与疾病基因治疗、高危人群筛查、早期预防具有重要意义。NAT2基因的多态具有显著的种族和地区差异，东方亚州人以快型为主。而西方白种人以慢型为主^〔8〕。本研究结果表明，对照组中快乙酰化者30例，占83.3%，慢乙酰化者6例，占16.7%，这与其他对中国人NAT2基因多态性分析研究结果近似^{〔9, 10〕}。

本研究结果显示，NAT2基因型慢型较快型的结核患者经抗结核药治疗后更易发生肝毒性，与文献结果一致^{〔7, 11〕}。这也提示检测肺结核患者NAT2基因的多态性，对指导其临床用药有重大意义。针对不同基因型的肺结核患者，采取不同的抗结核及保肝治疗，不但保证疗效，减少不良反应，而且减轻患者的经济负担及精神痛苦，有利于控制结核病的流行。