变态反应性疾病（过敏性疾病）被世界卫生组织认为是当前世界性的重大卫生学问题，各国总发病率为10%~30%^{〔1, 2〕}。在引起变态反应性疾病众多的过敏原中，腰果、杏仁和花生是主要坚果类过敏原。研究显示, 腰果过敏比花生过敏更为常见, 前者为74.1%, 后者为30.5%，腰果过敏儿童具有发生过敏的风险^〔3〕。我国1993年就有对腰果过敏的报道^〔4〕，近几年也常见报道^〔5-8〕。为探讨腰果过敏原的分离、纯化和免疫学特性, 为临床特异性诊断和分子生物学研究提供依据进行了本研究。现将结果报告如下。

过敏患者阳性血清来自深圳市人民医院和深圳市儿童医院确诊的腰果过敏患者血清12份，其中男性8例，女性4例，年龄7~56岁；血清中腰果抗体IgE检测均为3级。

腰果购于深圳市南山市场；生物素标记羊抗人IgE抗体（美国KPL公司）；链霉亲和素-辣根过氧化物HRP（美国Vector公司）；其他常用试剂（上海生工公司）。

取腰果100 g于冰浴中充分研碎成粉末后，加入5倍体积的预冷丙酮和乙醚于4 ℃交替脱脂，直到上清液澄清为止倒掉丙酮和乙醚，并在通风橱中风干。以1:10(w/v)的比例加入磷酸盐缓冲液(PBS)进行蛋白提取，4 ℃下磁力搅拌48 h。提完后用冷冻离心机在15 000 r/min，4 ℃条件下离心15 min，取上清液用PBS透析（透析带截流范围为6~8 kD），4 ℃下磁力搅拌10 h，期间换液5次，透析完后取50 ml进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），剩余样品经冷冻干燥后放入-80 ℃冰箱保存。

取30ml样品粗提液进行SDS-PAGE电泳，按凝胶的大小剪取硝酸纤维素膜（NC膜），将胶和膜放入电转缓冲液中平衡30 min后，在35 V恒压下，于冰箱中电转12 h。用2%牛血清白蛋白（BSA）封闭2 h后, 将膜放入10位对腰果过敏患者的混合血清（1:4稀释）中，在4 ℃冰箱过夜。后将NC膜转入生物素标记羊抗人IgE抗体（1：1000稀释）中摇2 h。链霉亲和素-HRP按1:500稀释后, 将NC膜放入其中摇2 h。最后二氨基联苯胺（DAB）显色，待条带清晰后即用水冲洗终止显色反应，摄像并保存。

在BIO-RAD常压层析控制系统下，用DE52离子交换层析柱纯化样品，以Tris缓冲液充分平衡系统后将腰果粗提液上样，最后改用1 mol/L NaCl的缓冲液进行线性洗脱。收集各峰液进行SDS-PAGE，并通过免疫印迹鉴定初步纯化后蛋白的免疫活性。

图 1

注：M：分子量标准；1：腰果粗提液蛋白条带。 图 1 腰果粗提液蛋白SDS-PAGE结果

结果显示, 腰果的蛋白区带分子量主要介于50~10 kD之间，蛋白条带分子量分别为50，33，30，26，25，23，21，19，17，14 kD，其中含量高的有5条，分子量分别为50，33，28，25和21 kD，其中以33 kD处最为富集，25~21 kD之间蛋白多且分布均匀。

图 2

注：M：分子量标准；1：过敏患者混合血清免疫印迹条带。 图 2 腰果过敏原免疫印迹鉴定图

图 2可见有2条明显的阳性条带，分子量分别为21和11 kD。

图 3

注: M:分子量标准; 1:为腰果蛋白粗提液; 2:第Ⅰ峰; 3:第Ⅱ峰; 4:第Ⅲ峰; 5:第Ⅳ峰。 图 3 腰果DE-52离子交换层析各峰液的SDS-PAGE结果

纯化蛋白得到4个洗脱峰, 电泳结果显示, 第Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰都富含腰果21和11 kD的蛋白，且21和11 kD占所有蛋白质组分的比例明显提高。第Ⅲ个峰纯化效果最好，第Ⅳ个峰基本不含蛋白。

图 4

注：M：分子量标准；1:腰果蛋白初提液；2~4为Ⅰ~Ⅲ峰的免疫印迹条带。 图 4 腰果蛋白纯化后1~3个峰的蛋白免疫印迹图

结果可见，第Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰都有2条阳性条带，分子量分别为21和11 kD，通过免疫印迹证明纯化后蛋白具有免疫活性，且能初步分离出21和11 kD过敏原蛋白。

随着人们生活水平的提高，食物过敏越来越受到人们重视。根据流行病学调查，在美国约有2%~2.5%人(600~700万人)出现过对食物过敏，婴幼儿发生率约4%~6%，儿童约1%~2%，成年人食物过敏者比例比婴幼儿低，但仍为1%~2%^〔9〕。食物过敏对人群健康的影响开始受到重视，成为全球关注的公共卫生问题之一^〔10〕，很大程度上危害着过敏人群的健康和生活质量。

坚果类是人们日常生活中最主要的一类食物，也是引起过敏性反应常见食物。坚果主要包括有腰果、杏仁、花生和核桃等。国内已分析了鲤鱼、刀额新对虾等多种食品过敏原蛋白成分进行分离、鉴定与纯化^{〔11, 12〕}，然而，对腰果主要过敏原的研究并不多见。本研究SDS-PAGE结果观察，腰果只有2个分子量较小的21和11 kD变应原与过敏性患者血清IgE有结合反应。腰果粗提液含量高的蛋白与其主要过敏原并不是对应关系，含量最高的蛋白（33kD）并不是其主要过敏原（21kD）。

腰果粗提液经过DE-52阴离子交换层析初步纯化后得到了含量较高的具免疫特异性的腰果主要过敏原蛋白，为临床该过敏性疾病的特异性诊断和深入进行分子生物学研究提供了基础依据。