盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CLB）为β-兴奋剂类药物，具有水解脂肪、合成代谢和对非条纹肌肉组织的松弛作用，动物养殖过程中用作促生长剂，提高动物的瘦肉产率^〔1〕。但CLB的残留会对人体健康造成危害。在农业部17号公告中明确规定盐酸克伦特罗为禁用药物。为了进一步研究CLB的生物学功能及开发克伦特罗的快速准确测定试剂(盒)，本实验利用CLB为包被抗原，从半合成噬菌抗体库中初步筛选出了具有CLB抗原特性的噬菌体ScFv抗体。现报告如下。

CLB抗原（国家标准物质中心）；人源化噬菌体抗体文库为轻链可变区和重链可变区经甘氨酸接头（Gly4Ser）₃的半合成抗体文库^〔2〕。辅助噬菌体M13KO7（北京纽英伦生物技术有限公司）；Wizard质粒DNA提取纯化试剂盒（美国Promega公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的鼠抗M13噬菌体（HRP/Anti-鼠抗M13）单克隆抗体（美国GE公司）；大肠埃希菌XL1-Blue为本实验室保存。其他试剂均为国产分析纯。ABI 377型自动测序仪（北京博迈德科技发展有限公司）。

将单链噬菌体抗体库经过培养和扩增、活化，用辅助噬菌体M13KO7超感染，30 ℃培养过夜，收集上清并用聚乙二醇（PEG）浓缩。用CLB抗原（质量浓度为1 μg/μl）包被Nunc培养板，包被液为0.05mol/L NaHCO3，pH 9.6缓冲液，4 ℃包被过夜。以牛血清白蛋白（BSA）37 ℃封闭2 h后加入浓缩的噬菌体，37 ℃放置90 min，以含有0.1%吐温20（Tween20）PBS (洗涤液)和PBS各快速洗涤20次，以0.1 mol/L三乙胺洗脱已吸附在平血上的噬菌体，然后用1 mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）（pH7.4中和液）中和，再感染对数生长复3次上述吸附-洗脱-扩增过程^〔3〕。

将最后一轮筛选得到的重组菌涂期的大肠埃希菌受体菌TG1，培养扩增使表达抗CLB特异性ScFv的噬菌粒得到富集。继续重平皿，从中挑选60株单克隆菌株，置于2×YT（含有氨苄青霉素100 mg/L，1%葡萄糖的培养基）中，37 ℃培养过夜。经辅助噬菌体M13KO7超感染后，30 ℃过夜。上清液用于酶联免疫吸附法（ELISA）检测。又以BSA作为包被抗原，结合与BSA的交叉反应情况，确定7株与BSA交叉反应较弱的阳性克隆进行竞争抑制实验，最后选定一个阳性克隆提取质粒，进行DNA序列测定^〔8-10〕。

10 μl噬菌体上清与等体积的以PBS/BSA稀释的2μg/ml CLB单克隆抗体混匀，于37 ℃孵育30 min。加入到包被有CLB单克隆抗体（0.2 μg/ml）的ELISA板中，37 ℃孵育1 h，用含有0.1% Tween20/PBS洗5次，然后加入1:5000稀释的HRP-鼠抗M13。37 ℃孵育1h，M13KO7为阴性对照，邻苯二胺（OPD）为底物显色^〔3〕。

由大肠埃希菌TG1-CLB1提取质粒pHEN1-CLB1，加入37 ℃NotⅠ酶切2 h，再加入SfiⅠ50 ℃酶切2 h；经琼脂糖凝胶电泳分析，按照DNA质粒回收试剂盒方法回收抗体基因片段，同样方法SfiⅠ/NotⅠ酶切PCANTAB 5E 载体质粒，经琼脂糖凝胶电泳分析，回收载体基因片段，在T4DNA连接酶催化下，连接CLB -1基因片段及载体片段，将连接物转化大肠埃希菌TG1-Blue (感受态细胞)；提取质粒，经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后，进行DNA序列测定分析。

单链可变区抗体特异性噬菌粒得到了富集结果可见：第1轮产出率（产出率=捕获的噬菌体数量/投入的噬菌体数量）为2.0×10^-6，随着淘洗次数的增加，从固相平板洗脱下来的噬菌粒数显示了增加的趋势，在第3轮筛选后结合到包被CLB平皿的噬菌体（产出率为1.0×10^-4）与第1轮相比，富集了50倍（富集倍数=第3轮产出率/第1轮产出率）。

图 1

注: 1~7为不同的克隆编号: CLB1~7; 0~016为490 nm波长读数。 图 1 阳性克隆的EL ISA及交叉反应结果

从第3轮筛选后得到的细菌集落中随机挑选60个克隆，用ELISA方法测定上清液中含有的噬菌体单链可变区抗体与CLB抗原结合活性。其中有15株ELISA的吸光度（A）值在490 nm读数数值较高。对这些噬菌体抗体进行与BSA的交叉反应试验后，确定其中有7株（CLB1~7）交叉反应较弱，结合3次ELISA重复试验的A值，最后确定1株阳性克隆（CLB-1）进行进一步的研究。

对筛选得到的阳性克隆取10μl噬菌体上清进行竞争抑制实验后，看出克隆株CLB-1抑制前吸光度(A)值波长490 nm时为0.540±0.02，抑制后吸光度(A)值波长为490 nm积分为0.056±0.02，根据抑制率公式：抑制率=（抑制前值-抑制后值）/抑制前值×100%，得出抑制率为80%。提取质粒，酶切后亚克隆到PCANTAB 5E载体上（E tag标签）。对亚克隆到PCANTAB 5E载体上的CLB-1菌株提取质粒进行SfiⅠ/NotⅠ双酶切鉴定，酶切鉴定结果表明DNA为750bp。

选择CLB-1送检测序，设计上游引物为：5′-CgTgAAAAAATTATTATTCgC-3′。下游引物为：5′-gTAAATgAATTTTCTgTATgAgg-3′。判断测序结果的开放读码框架（ORP）。将获得的推断的氨基酸序列经BLAST软件在GenBank数据-抗体库中进行同源性序列比较，最终判定引物的性质、cDNA核酸序列、基因组序列以及该基因在染色体中定位。该DNA序列片段约为729 bp，由320 bp重链可变区（VH），308 bp轻链可变区（VL）和101bp连接基因组成。但是它们具有不同的互补决定区，符合单链抗体的特征。

盐酸克伦特罗（Clenbuterol）是一种β-兴奋剂，应用于家畜饲养中可以提高脂肪动物型动物的瘦肉率和加速动物的生长。有报道，北京市近年在生猪产品不同组织器官样品CLB残留检测率从高到低依次为猪肺、猪肝、猪肉和猪肾；检出率为13.4%^〔4〕。在有关检测方法^〔5-7〕中通过杂交瘤技术产生人-人单克隆抗体十分困难。

人源化噬菌体抗体库能在体外通过相应筛选噬菌体而获的特异性的人单克隆抗体，解决了杂交瘤技术不易生产人单噬菌体而获得的特异性的抗体的问题。本研究以CLB包被为固相抗原在第3轮筛选后，使结合CLB的噬菌粒富集50倍。试验表明，从噬菌体抗体库中筛选出的CLB人源单克隆抗体具有较强的结合活性，且该方法具有简便、快速、经济等特点，避免了利用单克隆杂交瘤技术制备该抗体周期长，尤其是存在鼠源性蛋白反应的问题。ELISA和免疫组织化学技术鉴定，筛选得到的CLB单链可变区抗体具有较高的抗原结合性和较好的特异性。

用噬菌体抗体库技术已经获得了大量针对病原微生物的抗体，如人类免疫缺陷病毒（HIV）和衣原体抗体。由于胞内表达的优点在于表达量比较高，不易被胞内蛋白酶降解、利于纯化，但缺点是需要对表达的蛋白进行复性，一般回收率较低，在10%以内。另外，如果所得抗体特异性不强，对于后期进行亲和力动态测定-BIAcore（生物性互作用分析系统）等意义不大。因此，利用噬菌体抗体库技术只是初步得到CLB的人源单链可变区抗体，对其大量表达、纯化以及研究与开发农兽药，饲料添加剂残留检测试剂（盒）及样品的前处理方法正在探索之中。