沙门菌是食源性致病菌中一个主要的属，在各类细菌性食物中毒事件中，沙门菌造成的食物中毒位居前列^{〔1, 2〕}。常规的沙门菌检测方法费时费力，已经不能满足食品生产质量控制的要求^〔3〕。因此，需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法。Notomi等开发出一种新的恒温核酸扩增法-环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)^{〔4, 5〕}。本研究利用DNA环介导恒温核酸扩增法对市售不同生肉来源的沙门菌进行快速检测，并且着重在灵敏度和特异性方面对此方法进行验证，以建立的LAMP反应条件能够对今后病原微生物的检测研究工作提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 菌株

猪霍乱沙门菌猪霍乱亚种ATCC13312(S.ATCC13312)(广东省微生物研究所）；其余5株沙门菌HB009，HB371，HB069，HB215，HB143分别分离自市售的生猪肉、海产品、生牛肉、生羊肉和鸡肉。其他属菌株共14株保藏于本实验室，作为沙门菌环介导恒温核酸扩增反应特异性试验中的对照菌株。所有菌株均保存在质脂双层(LB)培养基中。

1.2 仪器及试剂

恒温金属浴锅(Thermocell, 杭州博日科技有限公司)；PCR扩增仪ABI2700(美国ABI公司)；凝胶成像系统(BIO-RAD Gel Doc EQ凝胶成像系统)。Bst大片段DNA聚合酶(爱尔兰Biolabs公司)；甜菜碱(分析纯，美国Sigma公司)；琼脂糖以及引物合成(大连TaKaRa生物公司)。

1.3 方法 1.3.1 LAMP反应引物设计

以沙门菌的属特异性基因invA^{〔6, 7〕}为靶基因，选择位于8 091~331之间的DNA序列作为LAMP扩增区域。将待扩增的DNA分为6个独立的区域，根据这6个区域分别设计LAMP反应所需2对引物(内引物FIP和BIP、外引物F3和B3)。FIP由F2和F1C两部分组成，BIP由B2和B1C两部分组成，其2个部分都能分别识别靶DNA正义链和反义链独立区域。外引物F3和B3分别识别靶DNA上F2和B2的外侧的独立区域，F3序列是5′-gcaacagctacgtgatga-3′；B3序列是5′-ctctattgccggcatcatta-3′。2对引物识别靶DNA上6个独立区域。FIP由22个碱基F1C和20个碱基F2，以及中间连接的TTTT组成，序列是5′-cttagatccccgcattgttggttttccgccacatattatcgcgat-3′；BIP由21个碱基B1C和20个碱基B2，以及中间连接的TTTT组成，序列是5′-gaccatcatgaatggtcagcattttattggcggtatttcggtcta-3′(引物由大连宝生物公司合成)。

1.3.2 LAMP反应

(1) DNA模板制备：DNA提取参照文献〔8〕。(2) LAMP反应体系：25μl反应混合物包括各1.6 μmol/L的FIP和BIP，各0.2 mol/L的F3和B3，1×恒温缓冲液，1 mol/L的甜菜碱，6 mmol/L的MgSO₄，1.6 mmol/L的dNTP，8 U/μl的大片断DNA聚合酶，1 μlDNA。(3)反应过程：除了大片断DNA聚合酶，将其余的试剂混合物于95℃反应5 min，使DNA变性。然后迅速于冰上冷却，并加入Bst聚合酶，将反应物混匀，置于65℃恒温金属浴中反应60 min，最后在80℃条件下反应5 min结束反应。(4) LAMP产物检测：肉眼观察反应物的外观变化并在2%琼脂糖凝胶上100 V电泳分离25 min，加样量7 μl/上样孔。凝胶置于EB中染色10 min，水洗10 min，在BIO-RAD Gel Doc EQ凝胶成像系统下照像检测。

1.3.3 PCR反应

50 μl反应总体积的组成：1 μl模板，各30 pmol外引物，1.25U Taq DNA聚合酶，10 mmol/L dNTP 2 μl，5μl 10×Buffer。扩增循环条件为：94 ℃预变性5 min，之后94 ℃变性30 s；52 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后延伸7 min。取PCR产物5 μl，在1%琼脂糖凝胶电泳上100 V电泳20 min，EB染色后在BIO-RAD Gel Doc EQ凝胶成像系统下照像检测。

2 结果 2.1 S.ATCC13312的LAMP反应条件试验

为了确立LAMP反应的条件，选择S.ATCC13312菌株的DNA作为扩增目标。结果从凝胶上230 bp大小的位置一直到上样孔处，出现了梯状的多条带，表明是发生特异性扩增反应。阴性对照没有添加扩增目标的模板DNA。

2.1.1 LAMP反应时间测试

LAMP反应在60~65 ℃都可以进行，并且在60 min内就可以完成。试验发现，反应温度在60~65 ℃之间结果区别不明显，只是65 ℃的时候生成产物量稍微多一些。所以，将LAMP反应的温度初步定在65 ℃。在65 ℃条件下，检测最快的反应时间，分别将反应时间设为15，30，45，60 min。每个时间对应的LAMP反应的S.ATCC13312 DNA的量均是10 ng。随着反应时间的延长，靶DNA的数量在不断增长，在45 min时，有迹象表明发生特异性扩增，时间延长到60 min时，产物大量生成。

2.1.2 LAMP反应引物试验

LAMP反应体系中，S.ATCCl3312 DNA的量均定为10 ng，设立每个体系分别缺失1条或2条引物，分别在65 ℃下反应60 min，反应结束后用2%的琼脂糖凝胶电泳分离、成像。只有当4条引物全部同时存在时反应才能进行。表明缺失任何一条引物都不能进行LAMP反应过程中链置换反应，不能形成哑铃状的DNA结构，从而使反应停滞。

2.2 S.ATCC13312的LAMP和PCR反应灵敏度比较试验(图 1)

将S.ATCCl3312的DNA依次进行10倍的稀释，最终使得DNA浓度分别为1 ng/μl，100，10，1 pg/μl，10，1 fg/μl。将稀释过的DNA分别取1μl于LAMP应中和PCR反应，检测这2种方法的灵敏度。结果可见，LAMP反应可以在60 min内，最低检测到100 fg DNA/管。PCR反应最低检测到1 pgDNA/管。

2.3 S.ATCC13312的LAMP反应特异性试验(图 2)

为了检测LAMP反应的特异性，分别在25 μl反应体系中，将100 ng的非沙门菌属的DNA与1 pg S.ATCC13312 DNA混合作为LAMP反应的扩增目标，65℃下反应60 min。观察LAMP反应是否受外源DNA的影响。结果可见，本试验设计的LAMP反应对S.ATCC13312是非常特异的。

2.4 LAMP反应检测不同食物来源沙门菌特异性试验(图 3)

利用已经建立的LAMP试验条件分别检测市售不同生肉来源的沙门菌(1 pg/μ1)，并且同时也利用相同的条件扩增其他属的细菌(10 ng/μl)，确认LAMP反应可以特异性地检测到沙门菌，反应条件同1.3.2。结果可见，本试验针对沙门菌特异性基因invA设计的LAMP反应，只对不同生肉来源的沙门菌是特异性的，在60 min内就能利用此反应快速地检测到。但是同样条件下，对非沙门菌检测均阴性。

3 讨论

本实验结果表明，根据沙门菌特异性invA基因设计的LAMP反应对于沙门菌的检测是非常快速有效的，它可以在恒温65 ℃条件下60 min内检测到目标菌的靶基因，凝胶上出现的梯状电泳条带表明特异性反应发生。同一反应体系中，检测靶基因的过程不会受到大量存在的非靶基因的影响，特异性很强。LAMP反应可以最少检测到100 fg的靶DNA，其检测灵敏度是PCR反应的10倍，这样，在利用LAMP方法进行检测时就会大大减少假阳性或者假阴性存在的可能。

LAMP方法是一种简便、快速、高效的基因扩增法，与PCR反应相比，LAMP反应最明显的优势是，在一般恒温条件下进行，所用设备简单、花费少，普通水浴锅或其他有稳定热源的装置就可以采用，不需要PCR所必需的精密温度循环装置，同时它的检测灵敏度和特异性又能满足快速鉴定病原微生物的需要，可以节约成本。所以，它可以作为常规检测工具，能够建立起总成本低廉的检测体系，在公共卫生安全检测、临床快速诊断以及环境监测等领域有实际应用意义。