中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (2): 214-215   PDF    
引用本文
高丽萍, 程书珍, 王晓梅, 贾丽霞. 铝对大鼠学习记忆及海马神经细胞凋亡影响[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(2): 214-215.
GAO Li-ping, CHENG Shu-zhen, WANG Xiao-mei, et al. Effect of aluminum on learning memory and apoptosis of hippocampus cells in rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(2): 214-215.
铝对大鼠学习记忆及海马神经细胞凋亡影响
高丽萍1, 程书珍2, 王晓梅2, 贾丽霞2     
1. 北京联合大学应用文理学院生物系生物活性物质与功能食品北京市重点实验室, 北京 100083;
2. 河北工程大学医学院
收稿日期: 2008-06-26
基金项目: 河北省科技攻关项目(06276102D-56)
作者简介: 高丽萍(1962-), 女, 四川江油人, 教授, 博士, 主要从事阿尔茨海默病的研究。
摘要: 目的 研究三氯化铝对大鼠学习记忆及海马神经细胞凋亡的影响. 方法 选择雄性SD大鼠, 按体重随机分为4组, 在基础饲料中添加三氯化铝, Al3+剂量分别为0, 11.2, 55.9和111.9mg/(kg·bw), 连续染毒3个月.采用Y-电迷宫仪检测大鼠学习记忆能力, 原位末端标记技术(TUNEL)和流式细胞术检测大鼠海马神经细胞凋亡, 原子吸收法检测海马铝含量. 结果 染毒Al3+111.9mg/(kg·bw)组大鼠逃避正确率为(0.83±0.115)%明显低于对照组(0.95±0.127)%, < 0.05);5.9和111.9mg/(kg·bw)组大鼠逃避潜伏期分别为(4.81±1.33), (5.55±1.79) s, 对照组(3.45±1.12) s明显延长(P < 0.05);染毒组大鼠海马均出现TUNEL阳性细胞, 且随剂量增加渐趋明显, 各染毒组大鼠海马神经细胞凋亡率及铝含量明显高于对照组(P < 0.01), 且呈明显剂量-效应关系. 结论 铝诱导海马神经细胞凋亡是导致大鼠学习记忆障碍的重要机制之一.
关键词： 铝     学习记忆     海马     神经细胞凋亡    
Effect of aluminum on learning memory and apoptosis of hippocampus cells in rats
GAO Li-ping, CHENG Shu-zhen, WANG Xiao-mei, et al     
Abstract: Objective To study the effects of aluminum trichloride on learning memory and apoptosis of hippocam puscell. Methods Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups based on the ir boby weight.Aluminum chloride was added into dietat doses of 0, 11.2, 55.9and 111.9mg/kg·bw for 90 days successively.L earning and memorya bilities were observed by Y-maze.The morphological characters and percent of neuronal apop tosis in hippocam pus were identified by teminal deoxynuleotidyl transferase-mediated nick-end labeling (TUN EL) and FACS scan.A luminum was measured by a tomic absorption spectroscopy. Results Correct escaping rate of the ratsin the dose group of 111.9mg Al3+/kg·bw was decreased.And escaping latency of rats exposed to doses of 55.9 and 111.9m g/kg·bw was prolonged significantly as compared with the controls.In hippocampus, TUN EL-positive cell could be detected in every treatment group.As the dosage of AlC l3 increased, TUN EL-positive appeared to be more obvious.The rates of apoptosis and luminum content in hippocampus in every treatment group were significantly increased with a singificant does-resp onse relationsh ip. Conclusion A poptosis induced by a luminum in rathippocampus might be one of the important mechanisms of the damage of learning and memory.
Key words: aluminum     learning memory     hippocam pus     nerve cell apoptosis    

随着对细胞凋亡的深入研究发现, 阿尔茨海默病(Alzheimer's AD)等一系列与中枢学习和记忆有关的疾病发生与神经细胞凋亡有关。铝作为公认的神经毒性物质, 铝的过量接触和体内蓄积可导致神经系统发生退行性改变〔1〕, 且动物实验和流行病学调查均表明, 铝可以引起学习记忆及认知能力障碍。为了进一步阐明铝引起的神经毒损伤机制, 本实验采用氯化铝对大鼠进行亚慢性染毒, 建立学习记忆障碍的大鼠模型, 并采用脱氧胸腺嘧啶介导的脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(TUNEL)、流行细胞术研究铝对大鼠海马神经细胞凋亡的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

SD大鼠, 体重(350±20) g (清洁级, 合格证号SCXK-00-0004北京医科大学实验动物中心); AlCl36H2O (化学纯, 天津双船化学试剂厂); 细胞凋亡原位检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection, 德国Bochringer Mannheim公司); 溴化乙锭(EB)染液(EC 2 mg, RNA酶2 mg, 枸橼酸钠200 ml, 生理盐水130 ml, 双蒸水70 ml, Triton-X100 2 ml); Y -电迷宫仪(张家港市生物医学仪器厂; FACS 420型流式细胞仪(美国BD公司); TAS-990型原子吸收分光光度计。

1.2 动物分组

选用SD大鼠48只, 采用普通饲料适应性饲养1周后, 按体重随机分为4组, 每组12只, 其中对照组喂普通饲料, 染毒组分别在普通饲料的基础上, 按体重8%的进食量添加AlCl36H2O, 分别为低、中、高剂量组11.2, 55.9, 111.9 mg/(kg·bw)。动物自由饮水, 动物房温度(20±2)℃。

1.3 动物处理

喂饲90 d后, 采用Y-电迷宫仪训练和测定大鼠学习记忆能力, 测试结束后, 从每组随机抓取4只大鼠, 按实验方法注射, 取脑组织(海马)后立刻固定于4%多聚甲醛中, 石蜡包埋用于TUNEL检测。剩余各组大鼠迅速断头处死, 在冰块上剥离脑组织, 取海马准确称重测铝含量, 剩余海马组织用70%冰乙醇4℃固定。用于流式细胞分析。

1.4 学习记忆能力测试

参照文献〔2〕, 在夜晚安静和避光的条件下, 用Y型电迷宫仪训练和测试大鼠的学习获得和记忆保持能力。

1.5 细胞凋亡检测 1.5.1 TUNEL法

采用In Situ Cell Death Detection试剂盒, 切片脱蜡至水后蛋白酶K室温孵育, 采用荧光素末端标记, 然后用酶标记的抗荧光素抗体与荧光素结合, 再与底物进行显色反应, 常规脱水、透明、封片, 在荧光显微镜下阅片, 拍照。

1.5.2 流式细胞分析

大鼠海马经70%冷乙醇4℃固定24 h以上, 采用网搓法制备单细胞悬液, 取制备好的单细胞悬液约1×106/ml, 低速离心去掉固定液, 用生理盐水冲洗2次, 加入EB染液, 置4℃冰箱反应0.5 h以上, 用流式细胞仪检测, 以亚G1峰的细胞占观察细胞总数的百分率为细胞凋亡的检测指标。

1.6 海马铝含量的测定

大鼠海马准确称重后, 加入5 ml消化液(高氯酸:硝酸=1:4)湿法消化, 待消化完后用去离子水定容至25 ml, 采用原子吸收分光光度计测铝的含量。

1.7 统计分析

采用SPSS10.0统计软件进行统计分析。

2 结果 2.1 一般状况

染毒期间各组大鼠体重差异无统计学意义, 染毒组大鼠精神萎靡, 常聚堆静卧, 及毛蓬松, 反应迟钝, 随染毒剂量增加症状愈加明显。

2.2 铝对大鼠学习记忆能力的影响(表 1)
表 1 铝对大鼠Y-迷宫逃避正确率和潜伏期的影响(…x±s)

2.2.1 铝对大鼠

Y-迷宫逃避正确率的影响(表 1)由表 1可见, 在连续前3d的测试中, 各染毒组大鼠逃避正确率均低于对照组, 但差异无统计学意义(P > 0.05);至第4 d, 高剂量染毒组大鼠的逃避正确率不再升高,而明显低于对照组(P < 0.05),各染毒组间大鼠逃避正确率差异无统计学意义(P > 0.05)。

2.2.2 铝对大鼠逃避潜伏期影响

由表 1可见, 连续训练3 d后, 第4d测定各组大鼠逃避潜伏期。与对照组比较, 3个染毒组大鼠逃避潜伏期均延长, 其中中剂量组与高剂量组大鼠明显低于对照组(P < 0.05), 各染毒组大鼠之间逃避潜伏期差异无统计学意义。

2.3 铝对大鼠细胞凋亡及海马铝含量影响(表 2)
表 2 铝对大鼠海马细胞凋亡率及铝含量的影响(…x±s, %)

2.3.1 铝对大鼠细胞凋亡的影响

FUNEL法观察细胞凋亡:在光学显微镜下, 各染毒组大鼠海马神经细胞可见明显染色阳性的凋亡细胞, 细胞核呈棕黄色, 由于细胞凋亡时细胞核的DNA可渗透到胞浆, 所以部分细胞胞浆也着色, 凋亡细胞数随染毒剂量增加而增加, 对照组大鼠胞内相应部位凋亡细胞少见, 即使有也着色浅。

流式细胞仪检测海马神经细胞凋亡率:在DNA直方图上, 各染毒组大鼠2倍体峰明显减少, G1/M (正常2倍体细胞DNA峰)左侧出现亚2倍体细胞峰群, 即凋亡峰。由表 2可见, 各染毒组大鼠海马神经细胞凋亡率明显高于对照组(P < 0.01), 且随染毒剂量增加细胞凋亡率随之增高, 呈现明显的剂量效应关系。相关分析表明, AlCl3剂量与细胞凋亡率之间呈显著正相关(r=0.9845, P < 0.01).

2.3.2 不同染毒组大鼠海马铝含量的变化

由表 2可见, 3个剂量染毒组大鼠海马铝的含量明显高于对照组(P < 0.01), 各染毒组之间海马铝的含量差异有统计学意义(P < 0.01), 且随染毒剂量的增加而增加。

3 讨论

铝是一种神经毒素, 易沉积于脑内而对中枢神经系统具有毒性作用, 到目前为止, 铝对学习记忆的抑制作用已在多数动物和人体上得到证实〔3-6〕。以往慢性毒性动物实验则常以腹腔注射或灌胃方式为主, 与人体实际情况下经水或食物的慢性摄铝方式不符。本次研究以食物中添加AlCl3的方式对大鼠进行亚慢性染毒, 采用电迷宫测定大鼠学习记忆能力。结果表明, 各染毒组大鼠逃避潜伏期出现不同程度的延长, 逃避正常率出现不同程度的下降, 其中以高剂量组最为明显, 提示学习记忆障碍大鼠模型建立成功。

铝引起动物学习记忆障碍的机制可能涉及多个方面。有报道〔7, 8〕, 有认知学习记忆障碍的老年性痴呆患者大脑皮层神经原数目明显减少, AlCl3可造成大脑皮层神经细胞突起萎缩, 细胞胞体增大变圆, 细胞数量减少。神经细胞的死亡是阿尔茨海默病的一个显著特征, 而细胞的死亡一般都通过2种方式, 即细胞凋亡或细胞坏死。本实验发现, 染毒组大鼠TUNEL阳性细胞数较对照组增加, 且随剂量增加渐趋明显; 各染毒组大鼠细胞凋亡率明显升高, 且呈明显的剂量-效应关系。提示凋亡的发生与铝的应用有直接联系, 铝可诱导海马神经细胞发生凋亡。同时, 随着染毒剂量的增加, 铝在脑内富集程度增加, 大鼠学习记忆受损程度均逐渐增加。因此, 细胞凋亡是铝损伤大鼠海马细胞的重要方式, 是导致大鼠学习记忆能力障碍的重要因素之一。

参考文献
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