有机磷农药所造成的环境污染已经引起全世界的关注，甲基对硫磷(Methyl，Parathion, MPT)做为一种毒性强、使用广泛且残留时间长的有机磷农药，对人类健康造成的威胁越来越受重视。有关甲基对硫磷生殖毒性的研究国内外均有报道，但其分子毒理机制尚不清楚，有研究认为可能与氧化应激有关^〔1〕。本实验通过研究大鼠睾丸组织内抗氧化体系的变化，以及该变化对睾丸细胞细胞周期和凋亡的影响，探讨其毒理作用机制。

甲基对硫磷原油(80%纯度，湖北沙隆达有限公司)；溶剂为橄榄油，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、考马斯亮蓝试剂盒(南京建成生物工程研究所)；RNA酶(分析纯，美国Sigma公司；曲拉通(Triton X-100)(分析纯，美国Amresco公司)；碘化丙啶(PI)(分析纯，美国Sigma公司)。电子天平，离心机，光学显微镜(0LYMPUS)，UV-1700紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；FACSCalibur流式细胞仪(美国Becton Dicknson公司)等。

采用健康清洁级SD成年雄性大白鼠20只，体重220~240 g。动物及饲料均由武汉大学实验动物中心提供适应性喂养1周后开始实验。

将大鼠随机分为4组，每组5只。参考Suresh S等〔2〕文献方法，MPT低、中、高剂量组分别为1.2，6，30 mg/(kg·bw)，连续6周灌胃染毒。染毒结束次日处死大鼠。对照组为橄榄油。

观察大鼠体重、饮食和水、活动情况及一般中毒表现。

准确称量大鼠体重和各脏器重量，按脏器系数=脏器重(g)/体重(g)计算各脏器的脏器系数。

附睾尾精子计数、精子活动度、精子畸形率参照文献〔3〕。

将大鼠睾丸制成组织匀浆液，离心后，取上清液，按试剂盒的方法测定其SOD活力、MDA含量、蛋白含量。

取约0.3 g睾丸组织，去除包膜，剪碎，加入4 ℃匀浆液1 ml并冰浴匀浆，200目筛网过滤，1 000 r/min离心8 min。取其中细胞沉淀重悬于匀浆液中，磷酸盐缓冲液(PBS)调整细胞浓度至10⁶~10⁷个/ml，4 ℃ 70%乙醇固定24h后，离心去除固定液，PBS洗2遍，加RNA酶20 μ1于37℃水浴30 min，加入800 μl碘化丙啶(PI)染液混匀，4℃避光染色30 min，然后上机进行检测。

采用SPSS软件进行单因素方差分析，并进行染毒组与对照组间的两两比较。

在给药期间，各组动物活动正常，生长发育尚好，未出现明显的中毒症状和不良反应。在给药后期，30 mg/kg组的部分动物皮毛失去光泽，精神状态稍差，体重增长有减缓的趋势，但差异无统计学意义。30 mg/kg甲基对硫磷组睾丸脏器系数与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05)，其余脏器未见异常。其脏器系数与对照组比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。

表 1

表 1 各组动物的精子数量、精子存活率和精子畸形率(x±s)

表 1 各组动物的精子数量、精子存活率和精子畸形率(x±s)

由表 1可见，染毒组动物的精子数量与对照组比较差异无统计学意义(P > 0.05)；与对照组比较，染毒组动物精子的存活率明显下降(P < 0.05)，精子畸形率显著升高(P < 0.01)；各染毒组间的两两比较，精子存活率差异有统计学意义(P < 0.05)，且随着染毒浓度的增加，精子存活率呈下降趋势；、精子的畸形率低剂量组和中剂量组之间差异无统计学意义(P > 0.05)。

表 2

表 2 各组动物睾丸组织中SOD活力、MDA含量

表 2 各组动物睾丸组织中SOD活力、MDA含量

由表 2可见，染毒组大鼠睾丸组织中SOD含量显著低于阴性对照组，且随染毒剂量的升高而下降；MDA含量与对照组比较差异有统计学意义，且随染毒剂量的升高而上升，但中剂量组和高剂量组之间差异无统计学意义(P > 0.05)。

表 3

表 3 各组动物睾丸细胞细胞周期和细胞凋亡的情况

表 3 各组动物睾丸细胞细胞周期和细胞凋亡的情况

由表 3可见，在睾丸细胞G0/G1期，中剂量和高剂量组细胞百分数显著高于对照组(P < 0.05或P < 0.01)；在G2/M期，高剂量组细胞百分比显著低于对照组(P < 0.01)；在S期，中剂量和高剂量组细胞百分数与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。

由表 3可见，随着染毒剂量的升高，大鼠睾丸生精细胞的凋亡率有升高的趋势，其中中剂量组和高剂量组大鼠睾丸生精细胞的凋亡率与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。

已有研究表明，甲基对硫磷可导致动物生殖器官重量减轻^〔2〕，精子数量减少，畸形率提高^〔4〕。本研究表明，MPT在30mg/(kg·bw)剂量下对大鼠的睾丸产生损伤作用；MPT染毒后，各剂量组均造成大鼠精子存活率的降低和畸形率的上升，且存在剂量-效应关系。本次实验结果显示, MPT染毒可以引起小鼠丸组织SOD活力降低, MDA含量增高，与文献〔1, 5〕结果一致，提示MPT可引起小鼠睾丸组织的脂质过氧化损伤，从而影响睾丸功能。

本次实验结果显示，在细胞周期与细胞凋亡方面，睾丸细胞G0/G1和S期，MPT各剂量组细胞百分数显著高于对照组；在S期，MPT高剂量细胞百分数显著低于对照组；MPT中剂量和高剂量组细胞凋亡率显著高于对照组，与刘基芳^〔6〕等研究结果相近，表明随着染毒剂量的增加，睾丸细胞的DNA合成受抑制，使睾丸细胞出现G2期阻滞，有丝分裂延迟，使进入M期的细胞百分数减少, Ap峰所占比例增加可说明凋亡细胞发生的百分率增加，表明MPT可诱导生殖细胞的凋亡，对生殖细胞造成损伤。

综上所述，长期暴露于甲基对硫磷可导致大鼠睾丸组织内抗氧化酶的活性下降，改变体内氧化抗氧化系统的平衡，从而导致生精细胞细胞周期的改变、凋亡的增加，使大鼠表现为生殖器官重量的下降、精子存活率的降低和畸形率的升高。甲基对硫磷诱导的氧化应激可能是其生殖毒性的重要机制。