中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (2): 197-199   PDF    
引用本文
潘沅, 林培政, 罗炳德, 刘叶, 万为人, 郭进强. 小鼠流感病毒性肺炎湿热证模型建立[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(2): 197-199.
PAN Yuan, LIN Pei-zheng, LUO Bing-de, et al. Establishment of animal model of damp-heat syndrome of influenza virus infection pneumonia[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(2): 197-199.
小鼠流感病毒性肺炎湿热证模型建立
潘沅1, 林培政2, 罗炳德1, 刘叶2, 万为人1, 郭进强1     
1. 南方医科大学公共卫生与热带医学院, 广州 510515;
2. 广州中医药大学
收稿日期: 2008-09-01
基金项目: 国家自然科学基金; 广东省联合基金(U0632009)
作者简介: 潘沅(1982-), 女, 广东人, 硕士在读, 研究方向:发热的病理生理学。
通讯作者: 罗炳德
摘要: 目的 建立小鼠流感病毒性肺炎湿热证模型, 为中药应用于湿热证治疗提供模型基础. 方法 将小鼠随机分为正常组、病毒组(单纯病毒感染造模)、模型组(肥甘饮食+湿热环境+病毒感染).采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测小鼠肺病毒含量.并与正常组、病毒组小鼠进行肛温、血脂、肺病变程度等方面的比较. 结果 正常组、病毒组、模型组小鼠的体重分别为(21.5±0.91), (19.44±1.55), (22.16±0.94) g, 模型组高于正常组、病毒组, 差异有统计学意义(P < 0.05);小鼠肛温分别为(35.8±0.4), (35.6±0.3), (36.6±0.4)℃, 模型组温度增高(P < 0.05).此外模型组血脂亦较其他2组升高明显.模型组、病毒组的肺指数和肺病变程度和正常组比较差异有统计学意义(P < 0.05). 结论 该模型无论发病条件、病变程度, 还有主要症状体征均近似于中医湿热证型, 操作简单, 重复性好, 有较高的应用价值.
关键词： 流感病毒     湿热证模型     肺炎湿热症    
Establishment of animal model of damp-heat syndrome of influenza virus infection pneumonia
PAN Yuan, LIN Pei-zheng, LUO Bing-de, et al     
School of Public Health and Tropical Medicine, Southern Medical University Guangzhou 510516, China
Abstract: Objective To establish the animal model of damp-heat syndrome of pneumonia caused by influenza virus infection for providing reliable model for traditional Chinese medicine in the treatment of dampheat syndrome. Methods Mice were randomly divide into three groups:control group, virus infection group (infected with influenza virus), model group (rich fatty and sweet diet+humid heatenv ironment+infected with influenza virus).RT-PCR was used to detect the quantity of virus in mice lungtissue.Anus temperature, blood fat, levels of lung pathological changes of the mice in different groups were compared. Results The average body weight of the mice in control group, virus group, model group was 21.5±0.91 g, 19.44±1.55 g, 22.16±0.94 g, respectively, with significant difference (P < 0.05).The level of anus temperature was 35.8±0.4 ℃, 35.6±0.3 ℃, 36.6±0.4 ℃, with significant increase in model group (P < 0.05).Compared to other groups, the blood fat level of model group obviously raised.The lung index and lung pathological changes of the model group and virus infection group were significantly different compared to the control group (P < 0.05). Conclusion The model was similar to damp-heat syndrome group in pathogenic conditions, cardinal symptom and signs.The method is simple and easy to establish with potential application.
Key words: influenza virus     damp-heat model     damp-heat syndrome    

湿热证是由外环境、机体的免疫状态、病原微生物共同作用的结果，具有时间性、地域性。流感病毒变异快、传染性强，对人类危害大。研究表明〔1, 2〕，流感病毒可导致湿热证形成。但目前以流感病毒作为生物感染因子的湿热证模型报道较少。本研究基于上述原因，模拟岭南地区高温高湿环境下感染流感病毒，建立了小鼠流感病毒性肺炎湿热证模型，并对其进行综合评价。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物和病毒

NIH小鼠，4周龄，雌雄各半(南方医科大学实验动物中心)；流感病毒甲1型(H1N1) FMl株(广州中医药大学)。

1.1.2 仪器与试剂

人工模拟高温气候舱(南方医科大学公共卫生与热带医学院)；YJ-875医用净化工作台(苏州净化设备公司)；AESROST全自动生化分析仪；GNTRIFOGE-TDL-160冷冻离心机；TANITAKD-160电子秤；数字肛温计(上海华辰医用仪表有限公司)；血脂4项原装试剂盒(珠江医院检验科)；乙醚(天津化学试剂有限公司)；无菌LB液体培养基(自制)；逆转录酶系、TaKaRa250 bp DNA Ladder (大连宝生物工程有限公司) r；2%琼脂糖凝胶(广州市达晖生物技术有限公司)；液氮(广州市旺气贸易有限公司)；Trizol (上海英俊生物有限公司)；Eppendof台式5415D型大容量高速冷冻离心机(德国Human公司)；DYY-6c型电泳仪(北京市六一仪器厂)；801凝胶成像分析系统(江苏省捷达科技发展有限公司)；ABl9700扩增仪(美国应用生物系统公司)。

1.2 方法 1.2.1 分组与造模

将动物分成正常对照组(正常组)、单纯病毒组(病毒组)、复合模型组(模型组)。每组6只小鼠自造模日起，常温饲养9 d，其中对照组和病毒组用普通饲料喂养，模型组用高脂饲料(普通饲料、蜂蜜、猪油以20:2:3的比例由广东省医学实验动物中心制备)第10 d时模型组及病毒组小鼠滴鼻感染甲1型流感病毒，攻毒量为30半数致死量(LD50)。对照组则滴鼻等量的无菌LB液体培养基。24 h后，将模型组置于人工气候舱进行热暴露，温度(32±0.5) ℃，湿度55%~60%，3 h, 隔日进行热暴露1次，共3次。

1.2.2 体重、肛温、血脂的测定

由造模之日起，于第1，7，10, 14 d称小鼠体重，并测定肛温，于第5，8，10 d测血脂，观察其变化。

1.2.3 病毒感染的确定

感染6 d后，每组随机抽取小鼠肺组织进行研磨，加Trizal提取组织RNA。在制备好的RNA中加入随机引物。参照GENEBANK中的甲1型流感病毒(H1N1)血凝素(HA)核苷酸序列，取HA (432 bp)片段，以Primer 5.0软件设计，由上海英俊生物技术有限公司合成。引物序列:Sense cgaccaaagagcacacaga Antisense gattccagctttaccccatc PRODUCT SIZE 432 bp。置入PCR仪中，37 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min完成cDNA的合成。从逆转录产物中取5 μl进行PCR扩增；93 ℃ 4 min预热，94 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 s延伸，72 ℃ 8 s延伸；变性延伸运行35个循环。

1.2.4 肺指数的测定和肺病变程度的判断

肺指数=小鼠肺重(g)/小鼠体重(g)×100；肺病变程度是肉眼判断，其病理改变评价标准:-肺组织正常；+细支气管周围及肺组织出现炎细胞浸润，间质毛细血管扩张充血，小部分细胞内有少量渗出:++细支气管内有大量炎性细胞浸润及轻度鳞状上皮生，肺泡渗出物增多，部分已经实变，间质纤维组织明显增生:+++肺组织大部分或者全部实变，支气管明显鳞状上皮化生，支气管被炎性渗出阻塞。

1.3 统计分析

采用Excel数据库和SPSS 13.0软件进行统计分析。

2 结果 2.1 一般状态

常温环境饲养，模型组小鼠体重增长快，皮毛油亮光泽；进入热环境，先有一段躁动期，活动量、饮水量增加，呼吸急促，继而进入安静状态，活动减少，散在静卧，呼吸仍旧急促。回到室温，约1 h恢复常态。病毒攻击后24 h，病毒组小鼠开始活动减少，进食，饮水量明显减少，模型组小鼠症状不明显。48 h后，模型组小鼠开始出现上述症状，病毒组症状加重，并有呼吸急促，扎堆蜷缩，反应迟钝等症状，体毛开始脱落。96 h后，病毒组小鼠爪甲紫绀，体毛稀疏，体重减轻并开始出现2只死亡(33.33%)。模型组小鼠也出现类似症状，但较病毒组小鼠轻，未出现死亡。

2.2 小鼠体重变化

喂养高脂饲料9 d后，模型组小鼠体重达(22.51±1.14) g，正常组和病毒组小鼠分别为(18.94±0.74), (18.43±1.21) g；14 d时，正常组为(21.5±0.91) g, 病毒组为(19.44±1.55) g, 模型组为(22.16±0.94) g; 感染病毒后，病毒组小鼠体重增长明显减缓，感染病毒并接受热暴露的模型组小鼠体重增长也有所减慢，但总体仍较其他2组重，各组相比差异均有统计学意义(P < 0.05)。

2.3 小鼠肛温变化(表 1)
表 1 间断热环境应激造模小鼠肛温比较(x±s)

结果可见，模型组小鼠在喂养高脂饲料后，肛温明显高于另外2组，在热暴露以后肛温逐步提高并趋向于稳定。

2.4 小鼠血脂水平的变化(表 2)
表 2 肥甘饮食对小鼠血清血脂水平的影响(x±s, mmol/L)

用高脂饲料喂养小鼠5 d后，胆固醇(CHOL)和甘油三酯(TG)已开始升高(P < 0.05)。高密度脂蛋白(HDL-C)升高明显(P < 0.01)。8 d后，CHOL及TG进-步升高，但HDL-C却有所下降，表明高血脂造成代谢紊乱HDL-C是机体对抗高血脂，加快血脂代谢的重要物质，由此表明8 d时，小鼠的高脂血症已经形成，并开始趋于失代偿状态。

2.5 病毒感染的确定

2%琼胶糖凝胶电泳鉴定结果可见，MARKER若干梯度条带清晰扩增片段大小，HA1在约430 bp附近最亮，与预期HA1大小(432 bp)相符，而正常对照组未见异常条带，证明已感染上病毒，由亮度大致可以判断病毒的含量，病毒组的病毒含量较模型组略高。

2.6 小鼠肺指数与肺病变程度

小鼠肺指数是衡量小鼠肺病变的指标，此次实验正常组、病毒组、模型组小鼠的肺指数分别为(0.79±0.11)，(1.88±0.33)，(1.59±0.24)。与正常组相比，模型组和病毒组都显著升高(P < 0.05)。其中，病毒组略高于模型组。从小鼠的肺病变程度可以看出，病毒组与模型组小鼠均出现病理上的改变，与正常组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。

3 讨论

早在20世纪80年代，郭金龙〔3〕就应用“气候+饮食”(即在高温高湿的环境下加上肥甘饮食)成功复制出湿热证动物模型。王新华〔4〕在此基础上又引入了生物感染因子。吴仕九〔5〕则用“气候+饮食+细菌/内毒素”对湿和热进行了量化。本研究拟岭南地区高温多雨的环境再加上高脂饮食导致机体血脂紊乱，脾胃损伤；并首次将病毒感染作为生物感染因子引入模型。发热是湿热证的主要表现之一。造模后，模型组小鼠的肛温比正常组、病毒组小鼠高约1 ℃，说明小鼠符合发病症状。周燕萍等〔6〕研究发现TG、CHOL及LDL在湿热证中升高明显。有研究指出〔7〕，血脂异常不应仅是TG、CUOL及LDL的升高，HDL降低也是其重要表现之一。实验中模型组小鼠与正常组、病毒组小鼠相比TG、CHOL逐步升高，调节转化机体血脂的HDL-C先升高后降低，说明脂质代谢开始紊乱。在评价模型内脏病变时，脏器系数是重要的判定标准之一〔8〕。此次实验模型组和病毒组的肺指数明显高于正常组；而且病毒组、模型组小鼠均出现病理上的改变，但病毒组小鼠发病急，死亡率高，个体差异大，难以总体把握，与病毒组相比，模型组的肺病变程度略轻，死亡率低，发病较缓，符合病势缠绵的特征，模型更易复制。本实验借鉴了莫日根等制作湿热症模型的方法〔9〕。以“环境+饮食+生物感染因子”复制出湿热证模型，从发病条件、体征，病变程度上均符合模型要求，且具有操作简单，重复性好等优点，有较高的应用价值。和大鼠模型、新西兰兔模型相比，小鼠体积小，适应力强，更适合实验研究。

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