中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (2): 193-195   PDF    
引用本文
王璇, 高玉霞, 常红, 刘莉, 杨海贤, 黄国伟. 维生素C、E对血管内皮细胞氧化损伤保护作用[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(2): 193-195.
WANG Xuan, GAO Yu-xia, CHANG Hong, et al. Effects of vitamin C and vitamin E on ultrastructures of vascular endothelial cells with oxidative damage in vitro[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(2): 193-195.
维生素C、E对血管内皮细胞氧化损伤保护作用
王璇1,2, 高玉霞3, 常红1, 刘莉1, 杨海贤3, 黄国伟1     
1. 天津医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室, 天津 300070;
2. 天津医科大学附属肿瘤医院病理科;
3. 天津医科大学总医院心内科
收稿日期: 2008-07-03
作者简介: 王璇(1979-), 女, 浙江宁波人, 助教, 硕士, 研究方向:营养与疾病。
通讯作者: 黄国伟
摘要: 目的 观察维生素C (VC)、维生素E (VE)对体外培养H2O2氧化损伤血管内皮细胞(VEC)超微结构的影响. 方法 采用体外细胞培养方法, 将血管内皮细胞分为正常对照组, H2O2氧化损伤对照组、VC+H2O2组(VC 100 μmol/L), VE+H2O2组(VE 100 μmol/L).分别将VC、VE加入到培养液中, 预孵24 h, 再加入除菌后的H2O2进行损伤, 终止培养后收集细胞, 进行电镜观察. 结果 透射电镜观察VEC, 可见H2O2损伤对照组细胞超微结构明显异常, 细胞表面呈光滑状, 丢失特征性的细胞突起及微绒毛; 胞质内线粒体损伤严重, 形态模糊; 粗面内质网明显扩张呈大囊泡状; 溶酶体增多; 少数细胞严重水肿, 核形不规则, 核内染色质部分溶解.VC+H2O2和VE+H2O2组血管内皮细胞超微结构仅有轻度损伤, 多数细胞与正常对照组细胞相似; 大部分细胞表面微绒毛和胞质突起均趋于正常, 胞质内细胞器均在正常范围内; 细胞核未见异常, 核膜完好, 核内染色质分布正常; 仅有少数细胞粗面内质网有轻度扩张, 线粒体结构模糊不清. 结论 VC、VE可一定程度保护氧化损伤的血管内皮细胞的超微结构.
关键词： 维生素C     维生素E     H2O2     血管内皮细胞     超微结构    
Effects of vitamin C and vitamin E on ultrastructures of vascular endothelial cells with oxidative damage in vitro
WANG Xuan, GAO Yu-xia, CHANG Hong, et al     
Department of Public Health, Tianjin Medical University Tianjin 300070, China
Abstract: Objective To observe the effect of vitam in C (VC) and vitam in E (VE) on the ultrastructures of vascular endothelial cells (VECs) following oxidative in jury in vitro. Methods VEC scultured in vitro were divided into normal control, H2O2 oxidative control, VC (100 μmol/L)+H2O2, and VE (100 μmol/L)+H2O2 groups.VECs were injured by H2O2 after they were incubated with different dosages of VC or VE for 24 hours.The morphological changes of VECs in each group were observed with the electronic mic roscope. Results The ultras tructures of VECs in the H2O2 control group were signif icantly different from that of the normal control.The cell surfaces were smooth with the losing of the distinctive cell processes and microvilli.The mitochondria in cytoplasm were damaged seriously and had dimappearance.The roughen-doplasmic reticula obviously dilated to big hollow vacuoles in shape.The quantities of lysosomes and endocellular pinocy totic vesic lesincreased.In a few endo the lial cells, swollen mitochond ria with invisible ridge and irregula rnucleus were seen.The chroma tin in nuclear was partly dissolved.In VC+H2O2 and VE+H2O2 groups, electron mic roscopic observation revealed that the ultras tructures of VECs were damageds lightly, most of cells in both groups had the same structures as in the normal control.The microvilli and cytop lasmic processes on the cell surface became common.The cellular organs in cytoplasm were normal.The abnormal nucleus were not seen and the nuclea membrane was intact, nuclear chromatin had normal distribution.Only a few cells hads lightly dilated roughendoplasmic reticula and unclear mitochondria. Conclusion To some extent, VC, VE can protect the ultra structures of VECs following oxidative in jury.
Key words: vitamin C     vitamin E     H2O2     vascular endothelial cells     ultrastructure    

心脑血管疾病是目前危害中老年人身体健康最严重的疾病之一。研究证明，氧自由基的形成与心脑血管疾病的发生存在因果关系〔1〕，有关氧自由基对心血管的损伤作用已受到广泛重视。过氧化氢(H2O2)是体内氧化代谢的中间产物，是一种危害性很大的氧自由基，可以穿透细胞膜到达细胞内，当积累到一定程度时就会造成血管内皮细胞的损伤〔2〕。为了探讨维生素C (VC)、维生素E (VE)对H2O2诱导的氧化损伤血管内皮细胞(VEC)超微结构的影响，本研究采用人脐静脉血管内皮细胞株ECV-304体外传代培养方法进行观察。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

(1)人脐静脉血管内皮细胞株ECV-304(天津市环湖医院)，胎牛血清培养液(DMEM)、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；新生胎牛血清(美国Hyclone公司)；30%H2O2(天津市东方化工厂)；维生素C (VC)、维生素E (VE)(美国Sigma公司)；2.5%戊二醛·多聚甲醛固定液(天津医科大学电镜室)。

1.2 方法 1.2.1 内皮细胞传代与培养

将冻存的内皮细胞复苏后，传至培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2、95%空气饱和湿度培养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM人工培养基培养。当细胞单层汇集达80%时，用0.25%的胰蛋白酶加等量0.2%的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)消化，将消化液吸出，移入离心管，加入DMEM培养液，离心，弃去上清液，加入新培养液，反复吹打后将细胞均匀接种于培养板。

1.2.2 VC、VE和H2O2制备

VC、VE均以微量无水乙醇溶解，再用含血清培养液稀释成相应浓度用于实验。30% H2O2无菌处理后，用含血清培养液稀释成相应浓度用于实验。

1.2.3 分组

当培养细胞呈单层“铺路石"样排列时，进行分组实验。将培养至融合状态的内皮细胞分为正常对照组、H2O2损伤对照组(终浓度为5 mmol/L)、(VC+H2O2)组、(VE+H2O2)组；后2组中, VC、VE终浓度均为100 μmol/L，H2O2终浓度与损伤对照组相同。在损伤前，VC、VE各剂量组分别加入含有VC、VE的培养液预孵24 h，然后加入H2O2进行损伤，继续培养4 h后，终止培养。

1.2.4 透射电镜观察

细胞终止培养，吸出培养液，用0.25%胰蛋白酶与0.2% EDTA等量混合消化液进行消化，待细胞悬浮后，移入1 ml离心管，800 r/min离心4 min，小心吸出上清液，立即加入2.5%戊二醛·多聚甲醛固定液做前固定，送检。标本经缓冲液充分浸洗后，以1%四氧化锇固定液做后固定30 min，上升梯度酒精脱水，Epon812环氧树脂包埋。瑞典LKB-Ⅴ型超薄切片机半薄切片(1 μm)定位后，进行超薄切片(厚度50~70 nm), 醋酸铀、柠檬酸铅染色，JEOL-100CX透射电镜进行观察并拍照。

2 结果 2.1 正常对照组内皮细胞超微结构(图 1)
图 1 正常对照组血管内皮细胞(×9900)

图 1可见, 体外培养的血管内皮细胞有极丰富的形态各异的胞质突起或微绒毛；细胞核及核仁较大，异染色质小块状或细颗粒状，分布于常染色质之间；胞质内有一定数量的线粒体、粗面内质网，微丝多散在或成束，多方向交叉分布；胞膜处的胞质中有明显的小胞饮泡，呈透明状；胞质中未见Weibel-Palade小体。

2.2 H2O2损伤后血管内皮细胞超微结构变化(图 2)
图 2 H2O2损伤对照组血管内皮细胞(×9900)

H2O2损伤后, 血管内皮细胞肿胀，核染色质部分溶解，粗面内质网囊状扩张，线粒体嵴融合变性，溶酶体增加，微丝团于胞质中央，细胞几近死亡；细胞表面微绒毛消失，呈光滑状。细胞核大有内陷。胞质内大部分线粒体内外膜及嵴融合，结构异常，并见大量溶酶体；粗面内质网扩张，膜溶解，形成透明泡状。线粒体内外膜融合，嵴融合呈球形或不规则形。

2.3 VC+H2O2作用后血管内皮细胞超微结构变化(图 3)
图 3 VC+H2O2组血管内皮细胞(×9900)

细胞表面有较多短小、纤细的微绒毛，细胞核及核仁结构完好，染色质均匀，线粒体较小而暗，仅有少部分粗面内质网轻微扩张；细胞表面光滑缺少微绒毛，紧密连接结构完好，细胞核及大部分细胞器结构完好。

2.4 VE+H2O2作用后血管内皮细胞超微结构变化(图 4)
图 4 VE+H2O2组血管内皮细胞(×9900)

细胞表面有突起，细胞间紧密连接结构完好，线粒体较小，部分线粒体的嵴和基质溶解，溶酶体增多；细胞表面微绒毛较少而短小，细胞核及核仁结构完好，染色质均匀，线粒体嗜锇性增强，部分嵴和基质溶解，少部分粗面内质网轻微扩张。

3 讨论

研究提示, 抗氧化维生素可一定程度地延缓动脉粥样硬化的形成和发展〔3〕，其机制可能与其参与抗氧化反应有关。本研究结果显示，H2O2损伤后, 血管内皮细胞在电镜下可见明显超微结构异常，加入高浓度的VC、VE后VEC超微结构仅有轻度损伤，多数细胞结构尚好, 与正常对照组细胞相似。VE与VC组比较，尚不如VC对内皮细胞的保护作用。因为VC组除线粒体略有损伤和溶酶体略增多外，其余细胞器损伤极轻微，未见核染色质溶解或其他损伤。而VE组在极少数的细胞内出现了小脂滴，甚至有细胞核染色质轻度溶解，虽是仅仅出现在个别的细胞中，但毕竟是较严重的损伤。说明高浓度的VE可能对VEC有潜在的损伤，这可能由于VE为脂溶性，而高脂对细胞有一定危害。

本文结果提示, VC、VE对H2O2损伤的VEC具有一定的保护作用，加入VC和VE保护的细胞形态未受到严重损伤，VC对H2O2损伤的血管内皮细胞的保护作用优于VE。原因可能在于H2O2是一种水溶性的氧化剂，而VC又是一种水溶性的抗氧化剂，因此VC可以更有效的发挥抗氧化作用。

参考文献
[1] 胡辉, 薛美荣. 抗氧化营养素、动脉粥样硬化与冠心病[J]. 国外医药:合成药、生化药、制剂分册, 1996, 17(2) : 85–86.
[2] 曹纯章, 卜丽莎, 高申, 等. 硒对培养大鼠心肌细胞抗氧化损伤作用的研究[J]. 营养学报, 2000, 22(4) : 298–302.
[3] Witte KK, Clark AL. Micronutrients and their supplementation in chronic cardiac failure.An update beyond theoretical perspectives[J]. Heart Fail Rev, 2006, 11(1) : 65–74. DOI:10.1007/s10741-006-9194-4