桑椹自古以来就是中医临床中常用的中药材，我国古代中医名著《本草纲目》就有桑椹“捣汁饮，解酒中毒；酿酒服，利水气，消肿”的记载，中医常用桑椹治疗贫血、神经衰弱、失眠、头发早白、心脏病、风湿性关节炎、支气管炎、水肿等疾病。桑椹中含有丰富的花青素，现代研究发现，花青素具有很强的抗氧化及抗炎作用^{〔1, 2〕}。大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)模型是研究类风湿性关节炎的重要模型^〔3〕。本研究采用AA大鼠模型，通过观察桑椹花青素对大鼠继发性足肿胀、血清氧化自由基、血清和继发性炎症区域炎症因子及血清一氧化氮(NO)的影响，进一步探讨其治疗类风湿性关节炎的作用机制。

(1)试剂：治疗风湿性关节炎常用药物：泼尼松(浙江仙居制药有限公司)；炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β) I¹²⁵放免试剂盒、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) I¹²⁵放免试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免研究所)；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒和NO酶法检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；弗氏(Freund’s)完全佐剂(美国Sigma公司)。(2)仪器：UV-1700分光光度计(日本岛津公司)；HH-4电热数字显示恒温水浴锅(上海金忠科学仪器有限公司)；LZ-1真空冷冻干燥机(上海医疗器械高等专科学校试验厂)；SN-682放射免疫γ计数器(上海原子核能研究所日环仪器一厂)。(3)动物：60只SD大鼠, 均为雄性, 体重180~220 g (第一军医大学实验动物中心)。(4)桑椹花青素：桑椹花青素为经X-5大孔树脂纯化、真空脱醇和冷冻干燥后得到的色素粉末，冷藏保存。

60只大鼠随机分为正常组、模型组，泼尼松治疗组，桑椹花青素高、中、低剂量组，每组10只。除正常组外，其余5组大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂0.1 ml致炎^〔4〕。造模后正常组、模型组灌胃给以生理盐水，泼尼松组给以泼尼松(30 mg/kg)，其余3组分别给以300，150和75 mg/kg桑椹花青素。每组每天均灌胃给药1次，给药28 d。在造模前和造模后每隔4 d用游标卡尺测量大鼠左后足厚度，造模判定标准依据文献〔3〕。

第28 d后，取大鼠全血，离心取血清，测定大鼠血清总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量。

取大鼠血清，采用放免法测定IL-1β，TNF-α。以硝酸还原酶法测定血清中NO含量。

致炎后第28 d处死大鼠，在非致炎侧踝关节上方0.15 cm处摘取肿胀足爪，纵向剖开，放入存有5 ml生理盐水中浸泡过夜，离心取上清，-20 ℃保存待测。关节浸液中TNF-α的测定采用放免法。

采用SPSS 10.0软件进行分析，组间差异采用多组间均数两两比较(SNK)检验。

表 1

表 1 桑椹花青素对大鼠左侧继发足肿胀的影响(x±s, n=10)

表 1 桑椹花青素对大鼠左侧继发足肿胀的影响(x±s, n=10)

表 1可见，大鼠致炎后14 d开始观测到左侧继发性足肿胀；花青素高剂量组与泼尼松治疗组对大鼠左侧继发性足肿胀抑制相似，差异无统计学意义。与模型组相比，桑椹花青素高、中、低剂量组左侧继发性足肿胀度明显低于模型组差异有统计学意义(P < 0.05)，表明桑椹花青素对大鼠继发性足肿胀有一定的抑制作用。

表 2

表 2 桑椹花青素对大鼠血清抗氧化力的影响(x±s, n=10)

表 2 桑椹花青素对大鼠血清抗氧化力的影响(x±s, n=10)

表 2可见，模型组与正常组相比血清中T-AOC、GSH-Px、SOD明显下降，MDA明显升高，差异有统计学意义(P < 0.01)，显示AA大鼠病变过程中存在着抗氧化能力的下降。泼尼松组和桑椹花青素高、中、低组与模型组相比，除泼尼松组GSH-Px模型组之间差异无统计学意义外，血清中T-AOC、GSH-Px、SOD活力明显升高，MDA明显下降，差异均有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)显示桑椹花青素能够显著提高大鼠血清中的抗氧化力。花青素高剂量组与泼尼松治疗组相比，T-AOC、GSH-Px活性优于泼尼松治疗组，总体对大鼠血清抗氧化力的影响相似。

表 3

表 3 桑椹花青素对大鼠炎症因子及血清NO的影响(x±s, n=10)

表 3 桑椹花青素对大鼠炎症因子及血清NO的影响(x±s, n=10)

表 3可见，与正常组相比，模型组的大鼠血清及关节浸液中IL-1β和TNFα明显升高，差异有统计学意义(P < 0.01)；花青素高剂量组与泼尼松组相比，差异无统计学意义；花青素高、中、低剂量组与模型组相比，血清和关节浸液中TNFα含量明显下降差异有统计学意义(P < 0.05)，花青素高剂量组血清中IL-1β明显下降差异有统计学意义(P < 0.05)。结果表明，桑椹花青素能够降低血清及关节浸液中IL-1β和TNFα的水平。与正常组相比，致炎组血清中NO的含量均明显升高；桑椹高、中剂量组血清中NO的含量明显低于模型组差异有统计学意义(P < 0.05)，优于泼尼松组，表明桑椹花青素在抑制血清中NO的合成有一定的作用。

虽经多年不断的研究，RA的病因仍未阐明^〔5〕。研究结果表明，氧化自由基和炎症因子及NO在RA的病理生理中起重要作用。氧化自由基会造成关节软骨损伤，抑制关节软骨DNA、基质蛋白多糖及胶原的合成，同时加速软骨基质的降解，导致基质细胞膜性结构的严重损伤^〔6〕。桑椹花青素属黄酮类化合物，含有酚羟基结构，具有较强的清除氧化自由基能力，能够剂量依赖性地清除自由基。

IL-1β和TNFα是单核或巨噬细胞产生的细胞因子，在RA发病机制中起着非常重要的作用，当免疫调节功能失调则诱导关节炎症发生或迁延发展^〔7〕。IL-1β和TNFα能够趋化吸引炎症细胞进入滑膜和关节腔内、刺激滑膜成纤维细胞和巨噬细胞产生大量前列腺素参与炎症反应；导致骨和软骨的破坏等^〔8〕，是关节炎发病的重要炎症介质。NO在炎症及其机制中发挥着两方面的作用，一方面NO促进炎症反应的作用包括使血管舒张、形成水肿和局部红斑、增加炎性渗出等，另一方面NO又可与前列腺素相互作用，调节一系列生理的和炎症的过程^{〔9, 10〕}。在关节炎发生发展过程，炎性反应细胞在细胞因子诱导下可产生NO，当大量NO生成时，则具有细胞毒性作用，造成组织损伤，关节发生不同程度的病变^〔11〕。

本实验结果表明，与正常组相比，模型大鼠血清中总抗氧化能力(T-AOC)降低，GSH-Px以及SOD活性也降低，MDA含量升高，血清及关节浸液中IL-1β和TNFα升高，血清中NO含量升高，提示AA大鼠病变过程中存在抗氧化能力的下降以及由此引起的细胞过氧化损伤和细胞因子网络平衡失调。而桑椹花青素能显著抑制大鼠佐剂性关节炎继发病变，使佐剂性关节炎大鼠抗氧化力提高、血清及关节浸液中IL-1β和TNFα的水平降低，抑制血清中NO的合成，从而减轻细胞的过氧化损伤，同时抑制细胞因子的促炎效应，减轻病理损伤。实验结果显示，桑椹花青素对大鼠佐剂性关节炎的防治作用可能与其较强的抗氧化活性相关。