中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (2): 170-171   PDF    
引用本文
石明隽, 肖瑛, 桂华珍, 郭兵, 张国忠. RhD阳性血影细胞抗原性及血浆抗-D抗体分离[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(2): 170-171.
SHI Ming-jun, XIAO Ying, GUI Hua-zhen, et al. Antigenicity of RhD ghost cells and its usage in separating anti-D antibodies from plasma[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(2): 170-171.
RhD阳性血影细胞抗原性及血浆抗-D抗体分离
石明隽, 肖瑛, 桂华珍, 郭兵, 张国忠     
贵阳医学院病理学生理教研室, 贵阳 550004
收稿日期: 2008-06-28
基金项目: 国家科技部攻关项目(2002BA901A19)
作者简介: 石明隽(1973-), 女, 水族, 贵州省三都县人, 讲师, 博士在读, 主要从事抗-D抗体的研究。
通讯作者: 张国忠
摘要: 目的 探讨用不同渗透浓度的磷酸盐缓冲液(PBS)制备的RhD阳性影细胞的抗抗原性及应用该细胞从低效价血浆中分离抗-D抗体的方法. 方法 用不同渗透浓度的PBS作为裂解液, 将遗传表现型为CCDee的RhD阳性O型红细胞制备成血影细胞, 观察其抗原性; 以血影细胞为固相抗原, 经亲和层析法从抗-D抗体含量为0.814μg/ml的健康人血浆中分离抗-D抗体, 检测相关指标. 结果 用pH7.4、30mmol/LPBS制备的血影细胞形态完整, 保持较强的抗原性; 用该细胞血胞成功获得抗-D抗体, 回收率达到84.65%, 其中IgG单体加二聚体含量为99.3%, 不含抗A、抗B血型抗体以及IgA、IgM和血红蛋白(henoglobin, Hb). 结论 用pH7.4、30mmol/LPBS制备的血影细胞可作为固相抗原从低效价血浆中分离纯化抗-D抗体.
关键词： RhD抗原     抗-D抗体     血影细胞     亲和层析     血浆    
Antigenicity of RhD ghost cells and its usage in separating anti-D antibodies from plasma
SHI Ming-jun, XIAO Ying, GUI Hua-zhen, et al     
Department of Pathophysiology, Guiyang Medical College Guiyang 550004, China
Abstract: Objective To explore the antigenicity of RhDghost cells prepared with using phosphate solution (PBS) at different concentration and the methods to separate anti-Dantibodies from plasm a contatining low titer antibody from the cells. Methods The ORhD positive group red bloodcells (geno type CCD ee) were employed to prep are ghost cells with phosp hate solution at 40, 30 and 20 mmol/L and the antigenicity of the cells was examined.The anti-Dantibodies were separated from helthy populationsπs plasm a containing anti-D01814μg/ml through affinity chromatog raphy (AC) with the ghost cells as solid antigen prep a red by PB of 30 mmol/L and the related parameters were examined. Results The ghost cells prepared with pH 4.0, 30 mmol/L PB kept complete cell morphological character and effective antigenicity.The anti-D antibodies were separated successfully by A C method from plasma and the recollection rate of anti-D was 84.65%.The content of IgG monomer and dimer together reached 99.3% of total IgG and no IgA, IgM and hemoglobin were found in the preparation. Conclusion The ghost cells prepared with pH 4.0, 30 mmol/L PB can be used as solidantigen to separate and puri-fyanti-Dantiboies from plasm a with low titter of anti-D.
Key words: RhDangtigen     anti-Dantibody     ghost cells     affinity chromatography     plasma    

抗-D抗体被广泛用于防止RhD同种免疫〔1, 2〕，同时也用于治疗特发性血小板减少性紫癜〔3, 4〕。目前临床使用的抗-D抗体均为经人为免疫而得的血源制剂〔5〕，而因妊娠等自然免疫而产生的获得性抗D抗体，由于其血液中含量少，未受到足够重视而加以利用。本文旨在探讨不同渗透浓度的磷酸盐缓冲液(PBS)对血影细胞的影响，以及探索用血影细胞从含低效价抗-D抗体的血浆中分离纯化该抗体的方法及其可操作性。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂与仪器

抗D含量为0.81 μg/ml、IgG含量为9.36 g/L的健康人血浆(贵州省血液中心)；Rh表型为（CCDee）的O型红细胞(贵州省血液中心)；效价为1：256的抗-D (IgG)血型抗体标准品(上海市血液中心)；荧光素标记为兔抗人IgG (深圳晶美公司，试剂批号为040803，1.0 mg/ml)；MININEPHTM人IgG试剂盒(英国The Binding site公司，生产编号为ZK004.R)；99/728抗-D抗体标准品(英国生物标准和控制国家研究所)；彩色IgG、IgA、IgM免疫单扩散板(上海捷门生物技术合作公司，批号040601)；8200型超滤器、截留分子量30KD的超滤膜(美国Milipore分司)；3K30型低温高速离心机(德国Sigma分司)；FACSCabiber流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；高效液相色谱仪(美国Waters公司)；MININEPSAN散射比浊仪(英国The Bingding Site公司)。

1.1.2 血影细胞的制备

用等体积生理盐水对Rh表型为CCDee的O型红细胞洗涤离心3次(1 000 r/min×5 min，4 ℃)；然后用pH 7.4，渗透浓度分别为40，30，20 mmol/L的PBS对其7次洗涤离心(20 000 r/min×15 min，4 ℃)至上清无色，沉淀即为含D抗原的血影细胞。

1.2 方法 1.2.1 血影细胞的形态和抗原性检测

在光镜下观察血影细胞的形态。将20，30，40 mmol/L的PBS制备的血影细胞与标准抗-D抗体于37 ℃孵育30 min后，离心(4 000 r/min×5 min，4 ℃)，取上清液，用RhD筛选细胞测定其抗体效价，标准抗-D抗体效价减去上清液效价的差值即可反映血影细胞的抗原性。在相同条件下重复检测5次。

1.2.2 血浆抗D-抗体的分离纯化

血影细胞用2%戊二醛以2%戊二醛：血影细胞=2：1的体积比固定30 min后与血浆按1：2的体积比例混合，37 ℃轻柔搅拌2 h，然后4 ℃，1 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀的细胞用10倍体积的pH 2.8，0.2 mol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱。然后常温下以1 000 r/min离心3 min，洗脱液用0.05 mol/L NaOH将pH调至6.0~6.5，在相同条件下重复2次，合并洗脱液，超滤浓缩至原血浆体积的1/5，过滤除菌，冷冻干燥，4 ℃保存。在相同条件下重复分离纯化7次。

1.2.3 终点散射比浊法测定IgG含量

免疫单扩散法检测IgA和IgM含量；高效液相色谱法测定IgG单体加二聚体含量；流式细胞仪测定抗-D抗体含量；邻甲联苯胺法行血红蛋白(hemoglobin, Hb)定性测定，试管法测定抗A、抗B血型抗体。

1.3 统计分析

采用SPSS12.0软件进行统计分析，组间差异用t检验。

2 结果 2.1 血影细胞形态

用渗透浓度为20 mmol/L的PBS制备的血影细胞形态不规则，混有较多细胞碎片；用30，40 mmol/L的PBS制备的血影细胞均呈透明圆形，未见明显细胞碎片；但40 mmol/L的PBS制备的血影细胞内含有少量Hb，细胞中心可见红色。

2.2 血影细胞的抗原性(表 1)
表 1 标准抗体与血影细胞孵育后测定5次上清液中的抗体效价

用20 mmol/L的PBS制备的血影细胞与抗-D抗体标准品孵育后有4次上清液中的抗体效价为1：128，最高1次为1：64；而用30，40 mmol/L的PBS制备的血影细胞与抗-D抗体标准品孵育后，上清液中的抗体效价均在1：16与1：32之间。

2.3 制剂的IgG和抗-D抗体含量及其回收率

用30 mmol/L PBS制备的血影细胞对血浆进行亲和层析得到的制剂中，IgG含量为(4.24±1.53) g/L (n=7)，其中单体加二聚体占(99.9±0.25)%(n=7)；抗-D抗体的含量为(3.45±0.31) μg/ml (n=7)；抗-D抗体的回收率为(84.65±7.85)%(n=7)；7次重复得到的制剂均不含抗A、抗B血型抗体以及IgA、IgM和Hb。

2.4 分离纯化过程对血影细胞的影响

用30 mmol/L PBS制备的血影细胞在2%戊二醛固定并经亲和层析后细胞略变小，而经过洗脱液洗脱后的血影细胞比固定后的细胞形体稍大，但这两种方法处理后的细胞均呈完圆形，细胞涂片光镜下未观察到细胞膜的碎片。

3 讨论

我们曾用柱层析法从低效价血浆中分离得到含抗-D抗体的IgG，再用经2%戊二醛固定的RhD阳性红细胞从IgG中纯化抗-D抗体。但由于历经柱层析和亲和层析2次分离纯化，抗-D抗体丢失较多，回收率仅约为72.6%。为提高抗-D抗体的回收率，直接用RhD阳性红细胞从含抗-D抗体的血浆中分离纯化该抗体。但经戊二醛固定30 min的红细胞与血浆接触后出现血红蛋白溢出现象，延长红细胞固定时间及灭活血浆补体均不能改善该现象。

鉴于RhD抗原仅分布于红细胞膜上，利用低渗裂解液将血红蛋白（Hb）从红细胞中释出Hb，成为具有D抗原性的血影细胞。鉴于30 mmol/L PBS，制备的血影细胞保持了较强的抗原性并且不带有Hb，应用此血影细胞与含低效价抗-D抗体的血浆进行亲和层析，成功分离了抗-D抗体，抗-D抗体回收率提高到了84.65%。同时制剂的总IgG量明显低于血浆中的含量，有不含抗A、抗B血型抗体以及IgM、IgA和Hb。

经过亲和层析，血影细胞的形态没有发生明显变化，提示有再利用的可能性。因此，用pH 7.4，30 mmol/L PBS将遗传表型为CCDee的O型红细胞制备为具有完整D抗原性的血影细胞，以此作为固相抗原与血浆进行亲和层析，可以从低效价血浆中分离纯化抗-D抗体，抗-D抗体的回收率较高，方法简单，有一定的可操作性。

参考文献
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