国外研究^〔1-3〕表明，5-羟色胺转运体(serotonin transporter，5-HTT)基因参与了许多疾病(如糖尿病、高血压、冠心病、恶性肿瘤等)的发病过程，目前已发现并报道的该基因结构及功能多态性共有20余种。维吾尔医学认为人体是由4种体液组成，即血液质、粘液质、胆液质及黑胆质，如果以上4种体液质发生质或量的变化就可能导致正常体液质改变，形成异常体液质(异常血液质、异常粘液质、异常胆液质及异常黑胆质)，从而导致复杂性疾病的产生^{〔4, 5〕}，如糖尿病、心血管疾病、高血压、重症哮喘、肿瘤等。本研究应用分子生物学方法从已知基因角度对异常黑胆质型患者和其他异常体液型患者的5-HTTLPR和5-HTTVNTR基因多态性进行分析，研究该基因的2个位点多态性与异常黑胆质型患者和其他异常体液型患者之间的内在联系。

从新疆和田地区墨玉县维吾尔医院选择全部102例异常黑胆质型患者和44例其他异常体液型患者(均符合维吾尔医学诊断标准及WHO诊断标准)，其中男性77例，女性69例，平均年龄为(55±16)岁；选择45名正常人(黑胆质型健康人)作为对照组；其中男性25名，女性20名，平均年龄为(50±16)岁。每份样品均为3代以内无异族通婚史且无亲缘关系的人血液标本。

采用盐析法^〔6〕。从冻存血液中提取基因组DNA。

(1) PCR引物系列设计如下：正向5′-GGCGTTGCCGCTCTGAATGC-3′，反向5′-GAGGGACTGAGCTGGACAAAC-3′(由上海生工生物技术有限公司合成)。(2) PCR扩增应用PCR扩增试剂盒（大连宝生物工程有限公司)：反应液共25 μl，含有50~100 ng基因组DNA，引物各10pmol，1.25 U长链PCR扩增酶(LA Taq DNA polymerase)，12.5 μl 2×GC (富含GC碱基)缓冲液，4 μl底物混合物(dNTPs)；PCR反应参数为：94 ℃ 5min预变性，然后94 ℃变性60 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环，72 ℃延伸10 min。将PCR产物在2%的琼脂糖凝胶电泳中进行分析，确定被研究者的基因型。

(1) PCR引物系列设计如下：正向5′-GTCAGTATCACAGGCTGCGAG-3′，反向5′-TGTTCCTAGTCTTACGCCAGTG-3′(由上海生工生物技术有限公司合成)。(2) PCR扩增应用PCR扩增试剂盒（大连宝生物工程有限公司)：反应液共20 μl，含有50~100 ng基因组DNA，10×PCR缓冲液2 μl，2 μl dNTPs，引物各10 pmol，1U Taq DNA polymerase。PCR反应参数为：95 ℃ 3 min预变性，然后95 ℃变性60 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min。将PCR产物在2%的琼脂糖凝胶电泳和6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行分析，确定被研究者的基因型。

确认基因型频率和等位基因频率符合Hardy-weinberg平衡后，应用SPSS 13.0统计软件进行χ²检验。按照文献^〔7〕方法计算5-HTTLPR和5-HTTVNTR的观测杂合度(Hobs)、期望杂合度(Hexp)和多态信息含量(PIC)。

用PCR共检出2个等位基因片段，即484bp (S)和528bp (L)，未发现超长的xL (616 bp)型的罕见等位基因片段；3种基因型分别为SS (484bp/484bp)、sL (484bp/528bp)和LL (528bp/528bp)。经计算，该多态位点的PIC为0.419, Hobs为0.444，Hexp为0.471。

图 1

注：1，7，9，10：纯合子S/S (484 bp/484bp)；8：纯合子L/L (528 bp/528bp)；2-6：杂合子S/L (484 bp/528bp)：M：DNA Marker (2000bp)。 图 1 5-HTTLPR的PCR产物琼脂糖凝胶电泳

图 2

注：1，2，7，10：纯合子12/12(30lbp/30lbp)；5，6，9：纯合子10/10(267bp/267bp)；3，4，8：杂合子10/12(267bp/301bp)；M：DNA Marker (100bp)。 图 2 5-HTTVNTR的PCR产物琼脂糖凝胶电泳

用PCR共检出2个等位基因片段，即267和301 bp，因为等位基因片段267和250bp比较接近，故用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等位基因片段为267bp的样本，以银染色法检验，未发现250bp的罕见等位基因片段。依串联次数由少到多排列依次为10，12；3种基因型依次为10/10，10/12和12/12。经计算，该多态性位点的PIC为0.205，Hobs为0.178，Hexp为0.232。

结果显示, 5-HTTLPR和5-HTTVNTR这2个多态位点基因型期望值与观察值之间差异均无统计学意义，即该患者组和对照组人群均符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则，表明该研究对象来自大的群体，个体间为随机婚配，无明显的自然选择、迁移等因素对遗传平衡的影响，吻合度好，资料的代表性好。

表 1

表 1 对照组与异常体液型患者组5-HTTLPR基因型和等位基因频率的分布

表 1 对照组与异常体液型患者组5-HTTLPR基因型和等位基因频率的分布

表 2

表 2 对照组与异常体液型患者组5-HTTVNTR的基因型和等位基因频率的分布

表 2 对照组与异常体液型患者组5-HTTVNTR的基因型和等位基因频率的分布

对照组5-HTTLPR的L/L纯合子基因型频率为15.56%，高于异常黑胆质型和其他异常体液型患者组的8.83%和9.10%；这3组的SL、SS基因型频率以及5-HTTLPR的等位基因频率相近，但差异均无统计学意义。这3组的5-HTTVNTR的基因型和等位基因频率比较，差异均无统计学意义。

近年研究发现, 5-HTTLPR基因多态性能调节5-HTT的转录。国外研究表明^〔8〕, L型等位基因基础转录活力是S型的2倍，5-HTTLPR可能通过影响基因的转录活性和5-HTT蛋白的功能而影响5-HT的回吸收速率，从而使5-HT系统功能不同。5-HTTVNTR基因多态性的功能目前尚不十分清楚。有研究表明^〔9〕，5-HTTVNTR这段重复序列可能在调节5-HTT表达方面发挥一定的作用。本研究结果显示：5-HTTLPR和5-HTTVNTR基因多态性总体上与异常体液质无关，提示这2个基因可能不是异常体液质发病的危险基因。但是χ2检验结果显示, 对照组的L/L纯合子基因型频率15.56%高于异常黑胆质型患者组的8.83%和其他异常体液型患者组的9.10%，推测可能是对照组L/L纯合子基因型高表达5-HTT，从而能够将效应部位的5-HT正常摄取，降低了异常体液质发病的易感性，提示L/L (插入，纯合子型)基因型可能是异常黑胆质发病的保护因子。通过PCR在5-HTTVNTR位点仅仅扩增出12和10拷贝的2种等位基因片段，所有样本均未见到9拷贝的等位基因片段，而且等位基因片段12的频率占明显的优势(频率约为85%)，这使该多态性位点的多态信息含量相应降低。此外, 异常黑胆质型患者组5-HTTLPR和5-HTTVNTR的基因型和等位基因频率与其他异常体液型患者组之间的差异也无统计学意义。