为了解大连市不同来源伤寒沙门菌菌株间同源性和遗传关系，本研究应用DNA指纹图谱构建技术-扩增片段长度多态性(AFLP)对分离自大连市和沈阳市散发病例粪便标本的30株伤寒沙门菌进行了分子分型分析。结果报告如下。

(1)菌株:伤寒沙门菌30株，其中2000~2006年大连地区散发病例分离株28株，2004年沈阳市地区散发病例分离株2株。(2)仪器与试剂:Eppendorf核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf公司)；PstI/Mse I型扩增片段长度多态性(AFLP)核心试剂(北京鼎国生物技术有限公司)。接头序列分别为:PstⅠ5' > CTCGTAGACTGCGTACATGCA，CATCTGACGCATGT < 5'；MseⅠ5' > GACGATGAGTCCTGAG，TACTCAGGACTCAT < 5'。预扩增引物分别为:PstⅠ5' > GACTGCGTACATGCAG < 3' MseⅠ5' > GATGAGTCCTGAGTAAC < 3'。

采用试剂盒中配备的DNA快速提取系统对分离培养的伤寒沙门菌株进行DNA提取。用1.2%琼脂糖凝胶电泳和Eppendorf核酸蛋白测定仪检测其纯度和含量。

限制性酶切及接头连接同步进行。限制性酶切及连接反应体系:样品模板DNA4 μl (50 ng/μl)，接头(Adapter)1 μl，PstⅠ/MseⅠ内切酶2 μl，10倍反应缓冲液(Reactionbuffer)2.5 μl，10 mmol/L三磷酸腺苷(ATP)2.5 μl，T 4连接酶(T 4-Ligase) 1 μl，无菌去离子水7 μl；混匀离心5 s，37℃保温5 h，8℃保温4 h，4℃过夜。

预扩增反应体系如下:10倍PCR缓冲液2.5 μl，Taq DNA聚合酶0.5 μl，dNTPs 0.5 μl，预扩增引物(Pre-ampmix) 1 μl，样品DNA 2 μl，加入无菌去离子水至25 μl，混匀，按下列参数进行PCR扩增:94℃变性2 min，然后94℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸80 s；30个循环，最后72℃延伸5 min。预扩增产物1:20稀释，作为选择性扩增模板。

分别选用9对引物组合进行选择性扩增，反应体系如下:预扩增稀释样品2 μl，10倍PCR缓冲液2.5 μl，dNTPs 0.5 μl，PstⅠ引物1 μl，MseⅠ引物1 μl，Taq酶0.5 μl，无菌去离子水17.5 μl，混匀，离心5 s，进行PCR循环。第1轮扩增参数:94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 80 s，以后每轮循环复性温度递减1.0℃，扩增10个循环。然后按下列参数扩增:94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 80 s；23个循环。扩增产物经4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，胶图由测序仪软件自动生成。

应用GENESCAN 3.1软件对自动测序仪得到的图片进行数据提取，通过Binthere软件提取样品各片段大小，最后用遗传统计学软件NTSYSpc-2.11F软件进行统计分析，通过树状结构(Treeplot)模块生成聚类图，进行聚类分析。

图 1

图 1 菌体总DNA电泳图谱

经Eppendorf核酸蛋白测定仪测定，提取核酸的吸光度A₂₆₀/A₂₈₀值在1.8~1.9之间。经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA分子量在20 kb左右，且亮度较大。

图 2

图 2 预扩增电泳图谱

预扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，可在紫外光下观察到70~1 600 bp间的弥散性条带，提示预扩增反应初步成功，说明预扩增产物众多，片段大小较为接近，难以区分。

图 3

1~27，30：大连分离株；28，29：沈阳分离株。 图 3 P-GAA/M-CAA引物选择性扩增后的基因组AFLP图谱

9对引物对所有30株伤寒沙门菌均能扩增出清晰可辨的条带，产生清晰的指纹图谱。除一些弱条带难以重复和分辨外，所有清晰条带均可稳定地重复扩增。供试菌株DNA选扩后产生的清晰条带数目为8~89条，分子量最小片段出现在69 bp位置，最大片段出现在498 bp位置，大多数条带聚集在480 bp以下。

不同年份分离株的相似性系数在0.35~0.78之间，多数株处于0.55~0.78间，除2株2001年的菌株在0.78的相似水平上相同外，其余各菌株在遗传上存在22%~65%的差异; 分离自沈阳地区的2株菌分属于2种AFLP型，与大连地区分离株的相似性较高，达0.6左右。根据各菌株之间遗传相似系数的计算结果构建的伤寒沙门菌的UPGMA聚类关系图可以看出:30株菌中只有01~16和01~24两株菌在78%相似性水平处为同一型外，其余各菌株呈离散状态，分属于28个AFLP型别。

本研究应用扩增片段长度多态性(AFLP)技术构建伤寒沙门菌D NA指纹图谱，选用PstⅠ和MseⅠ内切酶组合，以及3个选择性核苷构成的9组选择性引物。结果表明，选择性扩增后产生的条带数目和多态性优于Eco RⅠ/MseⅠ酶组合^〔1〕。供试的30株菌存在29个AFLP基因型，几乎一株菌一个型，说明散发菌株间存在较大的遗传异质性，这与徐文斌等^〔2〕用16 s RNA分型方法得出的散发菌株和非流行株的遗传距离相差甚远，聚集较为分散的结论有相同之处，同时也证明了AFLP技术在甄别菌株间基因差异的高度敏感性。30株伤寒沙门菌中，有23株在相似性系数0.55处聚为一大类，其中80%的2001年分离株聚集在0.67处，表明该年散发病例分离株之间遗传差异较小，而2006年的3株菌之间遗传差异最大，表明这3株菌可能具有不同的遗传背景。近年来，大连地区未发生伤寒的大流行和暴发，缺少暴发和流行菌株^〔3〕，有关不同流行方式的AFLP基因型分布情况有待进一步研究。