大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的次生代谢产物, 主要集中在豆类及豆类制品中, 由于其分子结构与雌二醇(Estradiol, E₂)相似, 在一定条件下既可表现为弱雌激素活性, 又可表现为抗雌激素活性。关于大豆异黄酮与乳腺癌关系的报道很多, 但结论并不一致。一方面认为大豆异黄酮可以抑制乳腺癌的发生; 另一方面又发现大豆异黄酮可以增加乳腺癌的发病风险。为了解其作用机制, 本研究观察了大豆异黄酮的主要成分金雀异黄素(Genistein, Gen)在低雌激素水平情况下对人乳腺癌细胞MCF-7的生长影响, 揭示其促癌作用的可能机制。

人乳腺癌细胞MCF-7(中国医学科学院细胞中心)。

金雀异黄素、雌二醇、活性炭、右旋糖酐(美国Sigma公司); 细胞培养基(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM)、无酚红DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司); 胰蛋白酶、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(美国Am-resco公司); Annexin V/碘化丙锭PI)双染试剂盒(北京大学人类疾病基因研究中心); 鼠抗人雌激素调节蛋白(PS₂) (中杉金桥生物技术有限公司)。

MCO-175型CO₂恒温培养箱(日本SANYO公司); 倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂); Mode1550型酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司); FASCAN型流式细胞仪(美国Becton-Dickinsin公司)。

活性炭使用前用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍, 用0.5%右旋糖酐配制成5%活性炭悬浮液, 与血清同体积混合, 56 ℃孵育30 min, 1 000 r/min离心20 min, 重复离心3次, 0.22 μm过滤除菌, -20 ℃保存。

人乳腺癌细胞MCF-7在含10%胎牛血清的DMEM中采用开放式单层贴壁培养, 培养条件为37 ℃, 5%CO₂, 饱和湿度, 待细胞生长至80%浓度时, 0.25%胰酶消化, 每3 d更换一次培养液。加受试物前7 d将细胞用PBS洗涤后改为含10%去雌激素胎牛血清的无酚红DMEM中培养, 以耗尽细胞内储存的雌激素。

将在去雌激素培养基中培养7 d的MCF-7细胞接种于96孔板, 细胞接种浓度为5 000个/孔。培养12 h待细胞贴壁后弃去旧培养基, 每孔加入200 μl含各浓度受试物的去雌激素培养基。以0.1%二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照组, E₂(10^-9 mol/L)为阳性对照组, 金雀异黄素设10^-7, 5 × 10^-7, 10^-6, 5 × 10^-6, 10^-5, 5 × 10^-5 mol/L 6个剂量组, 每组5个平行样。培养48 h后加入MTT溶液20 μl/孔, 继续孵育4 h后终止培养, PBS洗涤3次, 每孔加入150 μl DMSO, 振荡10 min, 酶联免疫检测仪上于波长490 nm测各孔吸光度(A)值, 结果以各组5孔吸光度值的x±s表示。计算在不同浓度金雀异黄素作用下MCF-7细胞的增殖率(Proliferation Rate, PR)。计算公式为: PR=(实验组吸光度值/溶剂对照组吸光度值) × 100%。

将经去雌激素培养基处理7 d的MCF-7细胞接种于25 cm × cm培养瓶中, 每一剂量组接种3瓶, 培养12 h待细胞贴壁后弃去旧培养基, 加入含各浓度受试物的去雌激素培养基5 ml (实验分组同前)。48 h后终止培养, 胰酶消化细胞, 制成单细胞悬液, 调整细胞浓度为1 × 10⁶个/ml, 用流式细胞仪在488 nm波长下测定细胞周期各时相分布百分比。

细胞处理过程同细胞周期测定, 按照凋亡检测试剂盒说明书进行操作, 取1 ml细胞, 1 000 r/min 4 ℃离心10 min, 弃上清后加入1 ml冷的PBS, 轻轻震荡使细胞悬浮, 重复离心2次。将细胞重悬于200 μl结合缓冲液(Binding Buffer), 加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Annexin V10 μl, 避光4 ℃反应30 min, 再加入300 μl Binding Buffer、5 μl PI, 用流式细胞仪检测细胞凋亡。

将经去雌激素培养基处理7 d的MCF-7细胞接种于25 cm × cm培养瓶中, 以0.1% DMSO为溶剂对照组, E₂ (10^-9 mol/L)为阳性对照组, 金雀异黄素设5 × 10^-7, 10^-6, 5 × 10^-5 mol/L 3个剂量组, 每一剂量组接种3瓶, 培养12 h待细胞贴壁后弃去旧培养基, 加入含各浓度受试物的去雌激素培养基5 ml。48 h后终止培养, 胰酶消化细胞, 2%多聚甲醛室温固定20 min, 洗涤液洗涤1次后加入0.3%曲拉通-X-100穿透液放置5 min; 于37 ℃加入2%山羊血清1 ml, 放置10 min, 于4 ℃加入人雌激素调节蛋白(PS₂)一抗工作液40 μl, 放置30 min后加入荧光标记的二抗FITC 40 μl, 放置30 min, 用PBS洗涤3次后上流式细胞仪检测。均以未加一抗的平行样品为阴性对照, 每组样品检测15个细胞, 以各样本的荧光强度和阴性对照组荧光强度的比值表示, 计算相对荧光强度。

采用SPSS 11.0软件进行分析, 组间均数比较采用单因素方差分析和t检验。

表 1

表 1 金雀异黄素对MCF-7细胞增殖的影响(x±s)

表 1 金雀异黄素对MCF-7细胞增殖的影响(x±s)

与DMSO对照组相比, 10^-7 mol/L Gen在培养48 h后可以促进细胞生长, 当浓度达到5 × 10^-7 mol/L时细胞数增加, 差异有统计学差异(P < 0.05)。并且随着受试物浓度的增加, MCF-7细胞增殖效应增加, 促进细胞增殖效应在10^-6 mol/L时达到最大。当受试物浓度 > 10^-6 mol/L时, 促增殖效应逐渐减弱, 在5 × 10^-5 mol/L时, 开始抑制细胞生长。

表 2

表 2 金雀异黄素对MCF-7细胞周期的影响(x±s)

表 2 金雀异黄素对MCF-7细胞周期的影响(x±s)

从细胞周期各时相分布来看, 当Gen浓度在10^-7~10^-5 mol/L时, S期细胞分布比例高于DMSO对照组, 提示在此剂量范围内Gen可以促使G₀/G₁期细胞向S期推进, 促进细胞DNA合成。当Gen浓度> 10^-5 mol/L时, 细胞周期阻滞于G₀/G₁期, S期细胞分布比例低于DMSO对照组, 抑制细胞DNA合成。

表 3

表 3 金雀异黄素对MCF-7细胞凋亡的影响(x±s)

表 3 金雀异黄素对MCF-7细胞凋亡的影响(x±s)

观察不同浓度Gen作用MCF-7细胞48 h后细胞凋亡情况, Gen浓度在10^-7~10^-5 mol/L时, 凋亡细胞所占百分比与DMSO对照组相比, 差异无统计学意义, 抑制细胞凋亡作用不明显。当Gen浓度> 10^-5 mol/L时, 细胞凋亡率有所增加, 并且以早期、中晚期凋亡为主。

表 4

表 4 Gen对MCF-7细胞人雌激素调节蛋白(PS2)表达的影响

表 4 Gen对MCF-7细胞人雌激素调节蛋白(PS2)表达的影响

根据MTT和流式细胞术试验结果, 选择有代表性的3个剂量组进行间接免疫荧光试验。Gen作用MCF-7细胞48 h后, 与对照组相比, 雌激素阳性对照组、5 × 10^-7、10^-6 mol/L Gen组PS₂蛋白表达增加, 差异有统计学意义(P < 0.05); 5 × 10^-5 mol/L Gen组PS₂蛋白表达减少, 但与对照组比较, 差异无统计学意义。

乳腺癌是全球第2高发的恶性肿瘤, 为女性发病率最高的癌症^〔1〕。我国近年来乳腺癌发病率也呈现快速上升趋势^〔2〕。目前以大豆异黄酮作为主要成分的保健食品被广泛用于预防和治疗女性更年期综合症, 但是关于其安全性还缺乏充分证据。有研究表明, 大豆异黄酮在一定条件下可能具有副作用, 导致雌激素依赖肿瘤的危险性增加^{〔3, 4〕}。

在证实大豆异黄酮可以抑制乳腺癌细胞生长的体外实验中, 所选择的剂量大都在10^-5 mol/L以上^〔5〕。但是研究发现, 即使是日常摄入豆制品剂量较高的人群, 血清中大豆异黄酮的浓度也仅保持在较低的水平^〔6〕, 由此可见人类很难达到在体外实验中所选择的剂量水平, 所得出的抑癌作用值得怀疑。本实验发现, Gen在低雌激素水平环境下可以促进细胞增殖以及DNA合成, 并且在10^-6 mol/L时促进作用最大, 与雌激素阳性对照组作用类似, 但是抑制细胞凋亡作用并不明显。另外Gen还可以促进PS₂蛋白的表达, 与对照组比较差异有统计学意义, 表现为一定的雌激素样作用。因此进一步验证大豆异黄酮对乳腺癌作用机制, 对于大豆异黄酮的合理应用具有重要意义。