硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase, TrxR)是含硒的吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶黄素蛋白家族成员, 是氧化型硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)还原的二聚体酶。哺乳动物TrxR分为3种, TrxR1主要存在于细胞质中, TrxR2主要存在于线粒体, TrxR3仅在睾丸中高度表达。TrxR有多种生物学活性与人类某些疾病发生发展有关, 可能是干预治疗的靶点^〔1〕。本课题组前期研究发现, TrxR2基因在抗砷细胞中表达上调, 在此研究基础上应用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术抑制抗砷细胞As-ECV304中TrxR2基因表达, 观察于扰前后抗砷细朐抗砷性改变, 研究TrxR2基因是否为抗砷细胞发挥抗砷作用的关键基因。

抗砷细胞系As-ECV304细胞及ECV-304细胞株由本实验室保存。抗砷细胞系As-ECV304由ECV-304细胞系在亚砷酸钠低浓度长期加压诱导而成。化学合成TrxR2基因si RNA片段序列: 1 Sense: 5′GGUGCCUUGGAAUGGAAR 3′, Antisense: 5′UUCCAUAUUCCAAGGCACCtt 3′; 2 Sense: 5′GGUCUAUCACGCCCAUUAUtt 3′, Antisense: 5′AUAAU GGGCGUGAUAGACCtt 3′; 3 Sense: 5′GGAGCAUGUUGAGGUCUAUtt 3′, Antisense: 5′AUAGACCUCAACAUGCUCCtt 3′。阴性对照干扰片段Sense: 5′UUCUCCGAACGUGUCACGUtt 3′, Antisense: 5′ACGUGACACGUUCGGAGAAtt 3′; 阳性对照GAPDH干扰片段Sense′: 5′ GUGGAUAUUGUUGCCAUCAtt 3′, Antisense: 5′UGAUGGCAACAAUAUCCACR 3′ (上海吉凯基因化学技术有限公司); NaAsO₂ (美国Sigma公司); 胎牛血清培养基DMEM (美国GIBCO公司)。Cell TES^TMPLUS DNA Reagent Kit (美国Becton Dickinson公司); 流式细胞仪FACSCalibu (美国Becton Dickinson公司); HiPerFect转染试剂(德国Qigen公司); TrxR2单克隆抗体(美国NeoMarkers公司)。

抗砷的As-ECV304细胞和正常对照的ECV304细胞接种于新鲜的DMEM培养基(内含10%胎牛血清), 37℃, 5% CO₂饱和湿度培养箱中培养, 取对数生长期细胞用于实验。

采用流式细胞仪检测As-ECV304细胞和正常对照ECV304细胞周期的改变。取处于对数生长期的As-ECV304及对照ECV304细胞, 调整细胞浓度以5 × 10⁵ /ml细胞接种于6孔培养板中, 继续培养36 h后胰酶消化收集细胞进行细胞周期检测。每次获取20 000个细胞, ModFitL T2.0软件进行细胞周期分析。实验重复3次。

取对数生长期As-ECV304细胞调整细胞密度接种于24孔培养板中, 每孔细胞数约1 × 10⁵, 总体积为500 μl, 分为未干扰组、阴性干扰片段、1, 2, 3号TrxR2干扰片段和阳性对照干扰片段共6组, 每组设3复孔。将细胞悬液加入到24孔培养板中暂时放入37℃培养箱, 室温下将适量HiPerFect转染试剂和siRNA片段加入到无血清的DMEM培养基中充分混匀, 室温放置10 min, 每孔加入4.5 μl HiPerFect转染试剂、4.5 μl siRNA片段和100 μl无血清的DMEM培养基, 干扰片段的终浓度为150 nmol/L。37 ℃, 5% CO₂培养箱培养72 h, 裂解收集蛋白进行蛋白印迹(Western Blot)检测。

收集干扰72 h的各组细胞的蛋白, 采用美国Bio-Rad电泳系统, 4%浓缩胶, 12%分离胶。将各组蛋白上样电泳, 之后进行电转移将蛋白转移至硝酸纤维素膜上, 用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h, 加入TrxR2单克隆(1: 50稀释)和内参β-actin (1: 1000稀释)单克隆一抗, 终浓度为4 μg/ml, 4 ℃封闭过夜, 洗3遍, 加入羊抗鼠和羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗(1: 5000稀释), 室温封闭1 h, 洗3遍, 显色10 min, 暗室曝光。

取对数生长期As-ECV304细胞用新鲜培养基调整细胞密度并接种于96孔培养板中, 每孔细胞数约5 × 10⁴, 总体积为100 μl, 设6复孔, 每孔加入1.5 μl转染试剂和1.5 μl siRNA片段, 使干扰片段终浓度为150 nmol/L, 以未干扰和进行阴性干扰片段转染的As-ECV304细胞为对照组, 培养24 h后弃培养基, 重新加入分别含NaAsO₂ 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64 μmol/L的培养基继续培养24 h, 每孔加入MTT工作液50 μl, 继续培养4 h, 每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 100 μl, 震荡溶解10 min, 酶标仪490 nm波长检测, 据各孔吸光度值反映细胞生存率, 求出生长抑制率和半数抑制率(IC50)。

流式细胞仪检测As-ECV304细胞和对照组的ECV304细胞在细胞周期分布上的差异。将2组细胞同时接种于6孔培养板培养36 h进行细胞周期的检测, As-ECV304细胞各周期分布分别是G0 /Gl期63.45%, G2 /M期12.51%, S期24.40%;对照组的ECV304细胞各周期的分布是G0 /G1期48.20%, G2 /M期16.84%, S期34.96%。As-ECV304细胞G0 /G1期细胞所占比例明显高于对照组, 并且S期细胞所占比率明显低于对照组细胞。

图 1

注: 1:未干扰组; 2:阴性干扰片段; 3: 3号干扰片段; 4: 2号干扰片段; 5: 1号干扰片段; β-actin作为上样质控。 图 1 干扰72 h后Western Blot检测干扰效率

将TrxR2的3个siRNA以及阴阳性对照siRNA转染入As-ECV304细胞72 h, Western Blot检测在干扰后各组细胞之间TrxR2蛋白表达量差异, 确定特异性的干扰片段。结果显示, 化学合成的TrxR2基因3个siRNA干扰片段均能发挥抑制基因表达的功能, 降低TrxR2蛋白表达量, 其中2号siRNA干扰效果最好。

As-ECV304细胞在转染TrxR2基因2号siRNA片段24 h后, 采用MTT法检测As-ECV304细胞的抗砷性改变。As-ECV304细胞在转染特异性的2号siRNA片段24 h细胞的生存率低于阴性转染组和未转染组。TrxR2 siRNA组、阴性siRNA组和未转染组细胞的IC₅₀分别为9.13, 15.88和18.52 μmol/L。

长期低剂量接触砷可以导致多种疾病和肿瘤发生率增加, 是世界性的公共卫生难题^〔2〕。而砷剂的长期使用部分患者产生了耐药性, 因此, 从分子水平研究人的抗砷机制对于解决地方性砷中毒和砷剂耐药性都有重要意义。本课题组前期用NaAsO₂成功诱导了稳定的人抗砷ECV304细胞系^〔3〕, 用基因芯片筛选出一系列抗砷细胞中高表达的基因, 包括TrxR2基因。本研究发现, 抗砷细胞中TrxR2蛋白表达水平高于对照组细胞, 抗砷细胞的增殖速度低于对照组的细胞, 提示抗砷细胞不具有恶性肿瘤细胞的特性, 与其他研究诱导的耐药细胞株具有相似的生物学特征^〔4〕。TrxR2基因表达被抑制后细胞抗砷性明显下降。Biorkhem等^〔5〕发现, 耐药的人肺癌细胞中TrxR的表达明显高于原代细胞系, 因此, TrxR表达升高可能是耐药细胞株的共性改变。

TrxR, Trx和磷酸甘油醛脱氢酶共同组成的Trx系统是细胞内重要的氧化还原系统, TrxR具有多种生物学活性^{〔6, 7〕}。TrxR2位于线粒体, 对维持细胞内的氧化还原状态非常重要, 其高表达使细胞耐受较高水平活性氧, 导致细胞对某些药物如砷剂的耐受性增加。用siRNA抑制TrxR2表达后细胞对多种毒物的耐受性下降^〔8〕。硒是TrxR等硒蛋白发挥抗氧化作用的必需物质。研究发现, 砷抑制TrxR蛋白的合成, 拮抗硒的作用, 增加致癌性^〔9〕。长期砷暴露降低硒蛋白水平, 补硒则降低砷在小鼠体内的蓄集而降低毒性^〔10〕。对于地方性砷中毒是否可通过补硒降低砷在人体内的蓄积毒性是一个值得讨论的问题。因为长期接触砷可能使TrxR的蛋白表达增加, 补硒还可增加TrxR活性提高人体细胞对砷的耐受性。TrxR在多种肿瘤细胞中高表达, 研究是新近发现的抗肿瘤药分子靶点。金诺芬、姜黄素可通过TrxRs发挥抗肿瘤作用^{〔11, 12〕}。最近发现, 砷通过抑制TrxR表达发挥治疗肿瘤的作用^〔13〕。因此, 深入研究TrxR2基因抗砷的分子机制有助于解决砷的耐药难题和TrxR抑制的新药研究。