磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine，SM₂) 作为一种广谱抗生素,普遍应用于医药（抗球虫药）、畜牧（作饲料添加剂以提高畜禽抗病力）以及水产养殖中（用于鱼、虾、蟹细菌性疾病），预防和治疗细菌感染性疾病^[1]。短时间大剂量或长时间小剂量的作用可引起急性或慢性中毒；能够诱发人的甲状腺癌和影响机体泌尿系统、免疫系统，破坏肌肉和肾脏等组织，并具有三致作用^[2],是国家农业部继克伦特罗后规定进出口检测必检项目之一。在残留药物检测的各种方法中，高效液相色谱(HPLC)及其联用技术成本昂贵,操作繁琐，放射性免疫检测技术则对机体有放射性损伤。酶联免疫吸附法(ELISA)因其兼顾灵敏度高和无放射性污染优点而被普及。为了探讨灵敏度更高，特异性更强和操作更简便易行的ELISA方法，制备具有独立知识产权的单克隆抗体，进行了本项研究。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

（1）细胞株及实验动物：分泌抗SM₂抗体的杂交瘤细胞株3D7，本课题组自行制备。10周龄健康BALB/c小鼠（卫生部长春生物制品研究所）。（2）主要试剂及仪器：SM₂标准品（中国兽医药品监察所）；蛋白分子量标记物（Marker）和辣根过氧化物酶标记酶(HRP-IgG)(大连宝生物公司)；N-二羟乙基甘氨酸(BCA)蛋白试剂盒(Bradford Protein Assay Kit，美国Piece公司)；其他所用试剂均为国产分析纯。倒置显微镜和CO₂培养箱（日本Olympus公司）；酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司）；细胞培养瓶及可拆卸酶标板（丹麦NUNC公司）。

1.2 方法 1.2.1 SM₂-单抗的制备和标记

复苏能够稳定分泌抗SM₂单抗4B12，腹腔注射石蜡致敏小鼠法制备腹水，正辛酸-硫酸铵法纯化腹水^[3]，BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度，采用改良过碘酸钠法用辣根过氧化物酶标记制备McAb-HRP^[4]，-20℃保存备用。

1.2.2 检测抗原的制备

重氮化法制备检测碳酸二甲嘧啶色被抗原（SM₂-OVA）。(1) 重氮盐溶液称取SM₂原粉280 mg，溶于6 ml的1 mol/L HCl，置于0～4℃冰浴，搅拌下逐滴加入2 mol/L的NaNO₂。(2) 称取250 mg OVA溶于10 ml、pH 9.4的Na2CO3·NaB4O7缓冲溶液中，搅拌下加入重氮盐溶液，用2 mol/L的NaOH调pH值至8～10，室温磁力搅拌反应3 h左右，反应物对NH₄HCO3缓冲液透析72 h，得SM₂-OVA，紫外扫描鉴定后冻干保存。

1.2.3 ELISA酶标板均一性试验

分别用照过紫外线和未照过紫外线的ELISA板，进行间接ELISA检测，根据SPSS 10.0统计软件分析有无差异性。

1.2.4 SM₂竟争抑制ELISA最佳工作条件确定

采用方阵法对包被抗原（SM₂-OVA）、抗体适用浓度、反应介质、反应时间等工作条件进行优化。选择对抗原结合反应抑制率高，抗原抗体用量少的试验组合作为最佳工作条件。其中包被抗原按1～0 μg/ml倍比横向包被酶标板，腹水单抗从8 000×开始倍比稀释，纵向加入酶标板，求得最佳条件。

1.2.5 SM₂的ELISA检测标准工作曲线

标准SM₂溶液按4 000～0 ng/ml稀释，用竞争ELISA法检测获得不同浓度下的吸光度(A)₄₉₀值，以抑制率（P/N%）值为纵坐标，以log(10×SM₂浓度)为横坐标绘制标准工作曲线。

1.2.6 样品模拟提取及回收

按文献[5]。用甲醇/水将10 g鸡肉组织（加入一定量SM₂）匀浆，正乙烷脱脂，氯仿萃取，蒸发定容。用所建立的2种ELISA法检测，SM₂含量计算按下式进行：SM₂含量(ng/g)=C×L×X/W式中：C为根据酶标板上测得A₄₉₀后由标准曲线求得log(10×SM₂浓度)，再通过反对数求得的SM₂浓度(ng)；L为样品提取液体积(ml)；X为样品提取液稀释倍数；W为鸡肉样品重量(g)。

2 结果 2.1 磺胺二甲嘧啶单抗的纯化与标记(图 1)

辛酸-硫酸铵法沉淀纯化腹水中抗体，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示，用辣根过氧化物酶标记纯化后的磺胺二甲嘧啶单抗去除了腹水中大部分杂蛋白。

2.2 ELISA酶标板均一性试验

取经紫外线照射过的ELISA板测得27个样品值为(1.241±0.023)，未照过紫外线的ELISA板测得27个样品值为(1.153±0.021)，经t检验，差异无统计学意义。因此，直接使用未经紫外照射的酶标板。

2.3 SM₂竞争ELISA方法的建立 2.3.1 SM₂竟争ELISA最佳工作条件确定

根据A值应在1.0～1.5之间，且包被抗原及单抗用量少的原则，方阵法确定的抗原抗体最佳工作浓度，包被浓度和最佳酶标抗体稀释度均分别为0.5 μg/ml和1∶4 000，最佳抗体稀释度为1∶160 000和1∶16 000；最佳包被条件为4℃过夜，药物竞争时间为37℃ 1 h，酶标二抗和底物作用时间分别为30和15 min，推举板内竞争方式。各条件优化后建立的ELISA程序如下：包被抗原100 μl/孔，37℃过夜；用含0.05%Tween-20的磷酸缓冲液(PBST)洗板3次，每次3 min；加入SM₂标准品或待检样品与相同体积McAb（1：160 000）或McAb-HRP（1：16 000）各50 μl，37℃板内竞争反应30 min；洗板3次；酶标羊抗小鼠IgG（1：4 000），每孔100 μl，37℃，30 min，洗板3次（直接法无此步骤）；加邻苯二胺（OPD）显色液，每孔100 μl，37℃，15 min；加入终止液，每孔50 μl，酶联免疫检测仪测定490 nm处吸光度(A)值。

2.3.2 SM₂的ELISA检测标准工作曲线

将SM₂贮存液用磷酸缓冲液(PBS)稀释成不同浓度的标准液，2种检测法检测获得A₄₉₀值并绘制标准工作曲线，间接法和直接回归方程与相关系数分别为：y=-26.728x+100.54，R₂=0.9985和y=-28.049x+105.7，R²=0.9954，线性范围分别为1.53～62和0.67～21 ng/ml，对SM₂的最低检出浓度分别为5.4和4.9 ng/ml。

2.3.3 SM₂加标回收(表 1)

在SM₂阴性的鸡肉样品中加入一定量的SM₂标准溶液，提取后用本文建立的竞争ELISA法进行检测，平均回收率为99.331%～88.687%。

2.3.4 2种检测方法的相关性分析

用所建立的2种竞争ELISA方法对加标样品进行检测。间接法和直接法标准曲线分别为y=-26.728x+100.54，R²=0.995 8和y=-28.094x+105.7，R²=0.995 4。结果显示，2种方法对不同加标量的检测均有较好的相关性，为99.99%。

3 讨论

本实验所建立ciELISA的关键是确定包被抗原和单抗的浓度。锁定包被抗原的基础上进一步确定单抗的最佳稀释倍数，而2次方阵滴定中倍比稀释包被抗原和单抗是为了显示出即使更低质量浓度的SM₂致A₄₉₀值发生明显的下降竞争效果。如果单抗过饱和则A₄₉₀值变化不明显，使方法的灵敏度降低^[6]。也有报道提出，不同的包被抗原联结方法可提高检测极限^[7]。因板内外竞争的效果差异不明显，故选择简单方便的板内竞争方式。但因为大多数游离半抗原与抗体的亲合性不如包被原载体上的抗原决定簇，加入样品和抗体的顺序对结果有一定的影响。

在本研究建立的抗SM₂的2种竞争抑制ELISA方法中，直接法检测速度快，线性范围宽，对样品的回收率较低；间接法灵敏度高，检测范围较窄，样品回收率较高^[8]。本实验结果显示，2种方法对同一样品检测的相关性较好，这为开发研制以SM₂单克隆抗体探针并具有我国自主知识产权的免疫检测试剂盒提供了良好的基础依据。