巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)属疱疹病毒β亚科，其感染在人群中广泛存在^{[1, 2]}。研究表明，妇女在妊娠初期感染CMV是引起胎儿宫内感染和发育缺损的重要原因，甚至认为其在致畸方面的作用比风疹病毒更为重要。CMV也是器官移植失败和艾滋病患者并发感染死亡的主要原因，对非免疫缺陷者常导致长期隐形感染或出现非特异症状，甚至引起感染细胞的转化、畸变或癌变，同时也与多种肿瘤的发生相关，如宫颈癌、前列腺癌、结肠癌及下波济肉瘤^{[3, 4]}。建立CMV感染的早期检测方法，用于孕妇的检查及献血员筛选，对于优生优育及阻断CMV传播有重要意义。检测CMV IgM抗体仍是目前最常用的早期诊断方法，尤其gp52蛋白的IgM抗体，在CMV感染早期有较高的检出率。本文成功构建表达gp52蛋白工程菌，建立了表达gp52蛋白的纯化方法，获得了高纯度gp52蛋白，有较好的抗原特异性，可作为抗原检测巨细胞病毒抗体。

（1）菌种、质粒与血清：大肠埃希菌BL21、巨细胞病毒全基因（北京现代高达生物技术有限责任公司）；pET-28a载体（华美生物技术有限公司）。经免疫印迹试验(WB)确定的CMV阳性与阴性血清（北京电力医院及辽宁省妇幼保健院）。（2）试剂：限制性内切酶Xho I、EcoR I、T4-DNA连接酶、DNA快速纯化试剂盒（北京TaKaRa公司）；琼脂糖、IPTG、蛋白酶K、蛋白质相对分子质量marker（美国Sigma公司；其他试剂为进口或国产分析纯。

通过计算机分析CMV全部氨基酸序列，筛选出强抗原表位，即从第2个氨基酸～第273个氨基酸,以其氨基酸所对应的核酸序列为目的基因设计PCR引物P01和P02；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：P01：5′-CGGGACTCGAGCCGCAACGGTCTG-3′，含XhoⅠ酶切位点；P02：5′-CGAATTCTTACGTTACAGAATCCTCGCT-3′，含EcoRI酶切位点和TAA终止密码。

取0.5ml CMV细胞培养上清液，加50μl蛋白酶K(10mg/ml)，混匀后至50℃消化4h，用酚/氯仿纯化，操作见文献[4]。以CMV基因组DNA为模板，进行扩增。PCR反应体系：水35.3 μl，模板DNA1.5 μl，10×buffer 5.0 μl，dNTP 4.0 μl，上游引物2.0 μl，下游引物2.0 μl，Taqplus 0.2 μl(1U)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并用DNA快速纯化试剂盒回收目的片段。

将纯化回收后的片段按常规的方法载入载体pET-28a，转化到大肠埃希菌感受态细胞中，碱裂解法抽提重组质粒，命名为pET-28a-gp52。经XhoI和EcoR I双酶切鉴定和PCR初步鉴定后测序，证实重组表达质粒构建成功。测序由北京赛百胜公司完成。

将表达质粒pET-28a-gp52转化大肠埃希菌BL21感受态细胞，铺LB琼脂平板(含50 (g/ml卡拉霉素)，于37℃培养过夜。然后挑单菌落于脂质双层(LB)液体培养基，37℃培养过夜。再按体积比1％的接种量接种于新鲜LB液体培养基，37℃培养至对数生长期，加0.4 mmol/L异丙基硫人β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导4 h。诱导菌体用15％SDS-聚丙烯酰胺疑胶电泳(SDS-PAGE)分析，表达gp52蛋白的菌株即为所需的工程菌株，用甘油冷冻保存。

将上述方法诱导培养工程菌5000 r/min离心5 min,每克菌湿重加3 ml裂解缓冲液 （50 mmol/L Tris-HCl,1mmol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)100 mmol/L NaCl）,超声波破碎菌体10 min；温度4℃，12 000 r/min离心15 min，上清为可溶部分，沉淀为包涵体。用2ml包涵体溶解液［8 mmol/L尿素、50 mmol/L氯合三羟甲基氨基甲烷Tris.Cl(pH8.0) ］溶解包涵体。包涵体溶解液上清上样于阴离子交换柱(DEAE-52)；用20 mmol/L Tris.Cl/8mol/L尿素(pH8.0) 充分洗去未结合的蛋白，然后用0.1～0.3 mmol/L NaCl梯度洗脱，同时收集蛋白。透析脱盐后，再上PEI离子柱，用0.1～0.5 mmol/L NaCl梯度洗脱。洗脱峰蛋白液透析除盐复性，再经DEAE-Sepharose FF阴离子柱，依次用含50，100，200，300，1 000mmol NaCl的平衡液洗脱蛋白，收集洗脱峰蛋白，用12％SDS-PAGE检测重组蛋白的组分。

用碳酸盐包被液稀释抗IgM(链抗体，包被酶标板，4℃过夜；次日用封闭液封闭，4℃过夜；每孔加入20μl待检血清和100μl辣根过氧化物酶-巨细胞病毒(HRP-CMV)gp52酶液（高碘酸钠还原法制备），37℃反应60min；磷酸盐缓冲液-T(PBS-T)洗板5次，每孔加A(过氧化氢)、B(过氧化氢尿素)显色液各50μl，37℃显色15min，每孔加50μl 2mmol/L H2SO4溶液终止反应，测定吸光度(A)值。

采用SPSS 11.0软件进行统计分析。

对有扩增产物的重组子质粒经XhoⅠ和EcoRI双酶切、鉴定，其中有3个重组质粒的双酶切产物在726 bp位置可见一明亮条带，大小与预期结果一致，无其他杂带。鉴定这3个重组子为阳性重组子，从中选取1个送赛百胜公司测序。测序结果表明，该质粒上确实插入了目的基因，且插入方向正确，为表达质粒pET-28a-gp52。

取1～4号转化子，培养后经IPTG诱导4 h，收集菌体进行SDS-PAGE检测。结果显示，2，3，4号蛋白条带诱导后出现清晰的gp52蛋白带，相对分子质量与推测结果一致，并且3，4号转化子溶液经处理后蛋白含量较高。

图 1

注:M:标准蛋白;1 :转化子诱导前;2 :诱导后;3 : Tris 裂解液溶解上清;4 :尿素溶解上清液。 图 1 gp52 蛋白表达菌的SDS-PAGE检测结果

经DEAE-Sepharose FF阴离子柱，在不同浓度NaCl洗脱下，收集峰值管进行SDS-PAGE分析（加样量10μg)。结果显示，凝胶经考马斯亮蓝染色和甲醇-冰乙酸脱色后，2份平行加样样本均呈1条蛋白带；再将3批不同克隆纯化的gp52扫描分析，分别占总蛋白的比例为96.2％,97.14％,95.8％，均有较高的纯度。

图 2

注:M:标准蛋白;1 ,2 :纯化蛋白。 图 2 纯化gp52 蛋白SDS - PAGE的分析结果

用酶标记gp52蛋白建立捕获ELISA法，与意大利SORIN公司ELISA试剂盒同时检测经WB法确定的35份抗巨细胞病毒IgM阳性血清和35份阴性血清。结果显示，35份阳性血清,用酶标记gp52蛋白建立的捕获ELISA法检出阳性34份,阳性检出率97.14%；SORIN公司ELISA试剂盒检出阳性33份，阳性检出率94.28%；35份阴性血清2种方法阴性检出率均为100％。2种方法比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。选取其中1份抗巨细胞病毒IgM阳性血清，进行1:1，1:2，1:4，1:8，1:16梯度稀释。检测结果显示，抗巨细胞病毒IgM阳性血清1:16稀释后仍能与gp52蛋白抗原反应，表明gp52蛋白抗原表位有较好的抗原特异性。

目前，巨细胞病毒感染诊断方法主要有脱落细胞及组织病理检查、病毒分离和抗原检测、分子杂交试验和血清学检查^{[3, 5-9]}，这些方法多基于高特异性的抗原建立。我国用于抗体检测的巨细胞病毒蛋白抗原，多是巨细胞病毒分离提取的多种蛋白混合物或代谢产物，抗原特异性不强，批间差较大，易产生假阳性。利用基因工程制备巨细胞病毒特异性的抗原是制备优质抗原的有效途径，国外已克隆表达了多个重组巨细胞病毒抗原，并对其抗原性进行了鉴定^[10]。本研究通过计算机软件分析CMV抗原表位及疏水区域，选定强抗原表位，利用基因工程技术在大肠埃希菌中进行了高效表达。高效表达的gp52蛋白抗原以包涵体形式存在，易于纯化，所获得的gp52蛋白抗原有较好的抗原特异性，可用作抗原检测巨细胞病毒抗体。将该蛋白抗原标记物用于检测试剂盒的制备，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，用于孕妇感染CMV的检测，对优生优育有重要意义。