自20世纪80年代，中国大陆、孟加拉等因饮用高砷水暴发大面积砷(As)中毒以来，慢性砷中毒已引起全世界的重视^[1]。流行病学调查显示^[2-4]，长期砷暴露可降低儿童的智力和记忆能力。但是，目前砷暴露致记忆障碍的分子机制尚不清楚。海马是学习记忆的重要部位。N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)是兴奋型氨基酸特异性受体的一种，近年来被认为是学习记忆中的关键物质。本文对砷暴露大鼠海马神经元超微结构和NMSAR亚基mRNA表达进行检测，以探讨砷暴露致学习记忆障碍的分子机制。

NaAsO₂(德国Merck公司)；As标准溶液(GBW08611国家标准物质研究中心)。

微波消解仪(奥地利Anton Paar公司)；原子荧光光度计(北京海光公司)；透射电子显微镜(荷兰飞利浦公司)；MyCycler梯度PCR仪(美国Bio-rad公司)。

健康断乳Sprague-Dawley雄性大鼠48只，体重40～50 g，(第三军医大学实验动物中心)。在标准SPF级动物房内饲养，人工控制昼夜变化。实验时随机分为4组：对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组12只。对照组饮用消毒自来水，染毒组分别饮用2.72，13.6，68 mg/L亚砷酸钠水溶液并每2 d换1次，连续染毒3个月。实验终期，大鼠经10%水合氯醛腹腔麻醉，心脏采血后，断头分离脑组织，将脑组织在冰冷生理盐水中漂洗，用滤纸吸干，置于-70度冰箱保存。

取脑组织0.2 g于聚四氟乙烯管，经微波消解后，用原子荧光光度计测定砷含量。

实验终期，大鼠经腹腔麻醉后，断头，在冰上快速分离海马，切取1 mm×1 mm×1 mm海马CA1区组织块，2.5%的戊二醛溶液4℃固定24 h。0.1 mo/L磷酸盐缓冲液漂洗，1%锇酸后固定，丙酮梯度脱水，环氧树脂-618包埋。半薄切片(片厚1μm)定位，超薄切片，饱和醋酸铀电子染色，TECNAI-10电子显微镜观察，照相。

引物序列如下：内参β-actin上游：5′-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3′，下游：5′CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3′，产物长度250 bp。NR1亚基上游：5′AGC GGG TAAACAACA GCA ACAAAA -3′，下游5′-GAA TCG GCC AAA GGG ACT GAA-3′，产物长度305 bp。NR2A亚基上游：5′-ATA CCG GCA GAA CTC CAC AC-3′，下游：5′-CCT CCA GTA GCC GTT CTC TG-3′，产物长度387 bp。NR2B亚基上游：5′GGC CTT CTT TGC TGT CAT TTT-3′，下游5′-AGT TCT TCC ATC TCC CCA TCT C-3，产物长度471 bp。每组随机选5只大鼠海马进行RT-PCR。按试剂盒说明书步骤提取总RNA，按常规方法制备cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR产物经1.7%的琼脂糖凝胶电泳，BIO-RAD凝胶成像分析系统进行灰度扫描。目的条带表达量的计算为目的条带灰度值/β-actin条带灰度值。

应用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差(One-Way-ANOVA)分析。

3个砷暴露组的大鼠脑砷均高于对照组，且脑砷值随饮水砷浓度的增高而增加；13.6和68 mg/L组脑砷值［(3.75+0.68) 和(4.33+0.64) μg/g］，与对照和2.72 mg/L组脑砷值［0和(0.44+0.09) μg/g］比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

(1) 神经细胞变化：对照组神经元细胞核形态规则，核膜光滑，染色质分布均匀；细胞器丰富，粗面内质网分布规则，网腔均匀一致，表面附有较多核糖体颗粒。实验组能见到许多神经元，胞体变小，胞浆浓缩，基质染色变深；细胞器肿胀、空化，线粒体肿胀，脊减少或无脊，粗面内质网扩张(图 1)。(2) 毛细血管变化：对照组毛细血管，周围结构正常，内皮细胞的胞核、细胞器及其外周的基膜清晰可见。实验组毛细血管内皮细胞中部分粗面内质网、高尔基复合体、线粒体可见明显的扩张(图 2)。

图 1

图 1 染砷组海马神经元

图 2

图 2 染砷组海马毛细血管

图 3可见，NR1亚基RT-PCR扩增产物长度为305 bp，内参β-actin 250 bp，与预期目的片断相同。大鼠海马组织NR1 mRNA在砷暴露后，各处理组与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。图 4可见，NR2A亚基RT-PCR扩增产物长度为387 bp，与预期目的片断相同。大鼠海马组织NR2A mRNA在砷暴露后，各处理组与对照组相比均明显降低(P＜0.05)。2.72，13.6，68 mg/L组分别为对照组的79%，80%和71%。图 5可见，NR2B亚基RT-PCR扩增产物长度为471 bp，与预期目的片断相同。大鼠海马组织NR2B mRNA在砷暴露后，各处理组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

图 3

图 3 NR1亚基mRNA RT-PCR扩增产物

图 4

图 4 NR2A亚基mRNA RT-PCR扩增产物

图 5

图 5 NR2B亚基mRNA RT-PCR扩增产物

砷是一种神经毒物，长期暴露于高砷环境，可引起失眠健忘等高级神经功能紊乱^[6]。动物实验表明，砷暴露可降低大鼠学习记忆能力^{[5, 6]}。透射电镜观察发现，染砷组大鼠海马神经细胞发生一系列病变。砷是一种原浆毒物，能抑制多种酶活性，影响细胞代谢。砷与脂质过氧化也有关，能抑制线粒体的生物氧化和三磷酸腺苷(ATP)的形成^[7]，从而使细胞超微结构发生变化，甚至细胞变性。毛细血管内皮细胞损伤，可导致血管通透性增加，降低血脑屏障对毒物的屏蔽作用。

NMDAR被认为是学习记忆的关键物质。NR1是其功能亚基，与学习记忆关系密切；NR2是其调节亚基，共4种亚型，完整的NMDAR至少含有1个NR2亚基。不同的NR2亚基组成的NMDAR对学习记忆功能的贡献也不同^[8]。特异性阻断NR2A亚基能消除突触的长时程增强(LTP)，特异性阻断NR2A亚基则消除突触的长时程减弱(LTD)，LTP与LTD的正常产生是维持良好学习记忆功能的基础^[9]。肖俊等发现，慢性砷中毒可抑制LTP的诱导与维持^[6]。本实验发现，砷暴露对NR1和NR2B的mRNA表达无影响，但明显地降低了NR2A的mRNA表达量，这将影响LTP诱导与维持。提示NR2A mRNA表达水平的降低，在砷致学习记忆功能障碍中起重要作用。

综上所述，慢性的饮水砷暴露可引起大鼠海马超微结构改变，降低NMDAR亚基mRNA表达，可能进而影响学习记忆功能。