人类免疫缺陷病毒 (HIV-1) 属逆转录病毒科慢病毒属, 其RNA中含有gag、env和pol基因以及6种调控基因[tat, vif, vpr, vpx (vpu), nef, rev]。其中gag基因编码成分是构成病毒颗粒的主要成分, 在成熟HIV病毒颗粒的包装和病毒颗粒从细胞膜上的释放等环节中发挥着重要作用。gag蛋白序列在HIV基因组中较为保守, 该区段被广泛用于HIV分子流行病学和HIV疫苗的研究中。本文经过体外扩增和序列测定得到湖北省HIV-1主要流行株gag区的P17/P24区段的近700bp长的基因片段, 并对该区段的序列特征、变异趋势进行了分析。结果报告如下。

采用分层和单纯随机抽样方法, 依据湖北省人类免疫缺陷病毒 (HIV) 不同感染途径的比例确定样本量, 共抽取HIV-1感染者102例, 占湖北省已发现并存活的HIV感染者总数的4.54％ (102/2 248) 。感染途径包括有偿供血、受血途径、感染者配偶/性伴、性乱途径、静脉吸毒途径。

调查对象经知情同意后, 采用统一调查表, 由调查员入户进行问卷调查并采集静脉血3～5ml, 乙二胺四乙酸 (EDTA) 抗凝混匀, 待检。

用淋巴细胞分离液分离外周血单个核淋巴细胞 (PBMC), 用DNA Blood Mini Kit (德国Qiagen公司) 提取其中的人基因组DNA, 其中整合有HIV前病毒基因组。

利用文献报道的多对引物, 以提取的DNA为模板, 用巢式PCR (nested-PCR) 对HIV-1 gag基因P17/24区约671bp进行扩增, 外侧引物为GagF2 (5´-ATG GGT GCG AGA GCG TCA RTA TTA A-3´) 和Gage2 (5´-TCC AAC AGC CCT TTT TCC TAG G-3´), 内侧引物为306 (5´-GGG AAA AAA TTC GGT TAA GGC C-3´) 和C-gag (5´-TAG TTC CTG CTA TRT CAC TTC C-3´) 。第1轮反应体系：总体积50 μl, 10buffer 5 μl, dNTP浓度200 μmol/L, Taq酶2.5 U, 引物浓度0.4 μmol/L, 核酸样本5 μl及相应的ddH2O。94 ℃ 5 min、52 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min 30 s, 1个循环；94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 30 s, 30个循环；72 ℃ 10 min, 4 ℃保温。第二轮反应体系：总体积50 μl, dNTP浓度、引物浓度、Taq酶用量及反应条件同第1轮, 模板为5 μl第1轮扩增产物。94 ℃ 2 min、50 ℃ 50 s、72 ℃ 1 min, 1个循环；94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min, 35个循环；72 ℃ 10 min, 4 ℃保温。每次扩增均设阳性和阴性对照。阳性对照选择1例病毒载量较高的HIV感染者血液核酸提取物；阴性对照选择健康成人血液核酸提取物。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 与标准对照判定无误后, 再用2%的琼脂糖凝胶电泳进行浓缩, 切下特异扩增条带, 用QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒 (美国Qiagen公司) 纯化扩增产物, 回收所得DNA溶于10mmol/L Tris-HCl (pH 8.7), 再经琼脂糖凝胶电泳与分子质量标准比较, 估算核酸浓度。

以第2轮PCR内侧引物306为测序引物, 以提纯的PCR产物为模板, 进行序列测定, 测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

以Bioedit和Clustal X等软件将得到的序列进行排列, 并与美国Los Alamos国家实验室专业HIV 核酸序列库 (HIV Database) 的国际标准参考序列比较, 使用Mega软件的Distances功能的Computer Pairwise方法计算基因距离, 并使用Mega软件的Neighbor-joining方法绘制系统进化树。用美国Los Alamos国家实验室HIV核酸序列库中提供的基因分型工具BLAST程序结合系统树分析进行基因型鉴定。

使用Excel和SPSS软件进行统计学分析。比较基因距离的差异用x²检验；基因距离的变异性分析使用描述性分析。

共获得52株包含有gag基因P17/24区的序列, 经序列数据库搜索系统（BLAST）程序结合系统树分析发现, 其中B´亚型序列43株, 占82.69%, CRF08-BC、CRF01-AE重组毒株各4份, 均占7.69%, C亚型1份, 占1.92%。表明B´亚型为湖北省HIV-1绝对优势流行株。

图 1

图 1 PCR 产物电泳图谱

将湖北HIV-1主要流行株B´亚型gag基因P17/24区序列的平均基因距离分别与各亚型的国际标准毒株进行比较。结果显示, 湖北省HIV-1主要流行毒株B´亚型之间的平均基因距离为4.03±1.83, 与我国河南地区的B´亚型毒株B.CN.02.02 HN之间的基因距离为3.35±0.86, 与云南地区的B´亚型代表株RL42之间的基因距离为3.66±1.39, 与欧美B亚型代表株FR.83.HXB 2之间的平均距离为5.99±0.62, 而与其他亚型、重组亚型之间的平均距离均在10以上。

为从氨基酸水平了解湖北省HIV-1主要流行株的变异情况, 使用Bioedit 和Clustal W软件将31份HIV-1B´亚型毒株的gag基因P17/P24区域的核苷酸序列分别翻译为氨基酸后排序, 并产生共享序列。结果显示, 湖北省HIV-1 B´流行株在P17、P24区表现出不同的变异情况, P17突变位点较多, P17尾部与P24交界的部位少数序列发生位点插入和重复等变异, 但不影响下游P24的翻译, P24较为保守, 仅部分序列的少数位点发生点突变。将该共享序列与B´亚型标准株RL42比较, 二者仅在P17区4个位点发生点突变, 分别为第24位AS；第47位LQ；第80位GD；第88位AV；二者在P24区域完全一致。表明湖北HIV-1 B´亚型与RL42有高度同源性, 并保持了较高的保守性。

基因序列同源性分析结果表明, 湖北省HIV-1主要流行株B´亚型gag基因型内基因距离为4.03±1.83, 与我国河南地区的B´亚型毒株及云南地区的B´亚型代表株最为接近, 它们之间可能有高度的同源性, 而与其他地区的代表毒株距离较远。既往研究显示, B´亚型来源于泰国等东南亚地区, 经吸毒途径传入我国云南省, 后从河南省等地经违法违规采血传向湖北省等全国大部分地区^[2-4]。本次研究证实, 湖北省HIV-1主要流行株来源于此途径。

氨基酸序列变异分析结果与B´标准株RL42比较, 二者仅P17区4个位点发生点突变, 其他位点完全一致, P17尾部与P24交界的部位常出现碱基的突变、缺失、插入、重复等现象, 该区变异较大, 但不影响下游P24部分的正常翻译, P24区则表现为高度的保守性, 仅部分序列的少数位点发生点突变, 该结果与关琪等的报道完全一致^[5], 表明湖北省HIV-1 B´亚型与RL42有高度同源性, 并进一步证实上述结论。

近年来由于经性途径和静脉吸毒传播日趋增多, HIV有向其他人群传播的趋势^[6]。本文结果表明, 湖北省流行的HIV-1亚型由以往的单一的B´亚型^{[3, 7]}增加到了4种亚型, 即B´、C等2种亚型以及CRF01-AE、CRF-BC等2种重组亚型^[8]；第2次全国艾滋病分子流行病学调查结果公布的我国居前3位亚型为CRF-BC、B´、CRF-AE, B´亚型已由原来的第1位降至第2位, 而CRF-BC亚型则上升为第1位, 同时CRF01-AE亚型所占比例也有所增加, 这说明重组毒株具有更强的传播优势^[9]。湖北省流行的3种优势毒株与该结果一致, 但B´亚型仍然是绝对优势毒株, 感染人群已由有偿献血员波及受血者及其配偶、性伴和其他人群；而CRF01-AE、CRF-BC重组毒株的出现和增加, 说明重组亚型已在湖北省性乱人群中传播, 并有扩散的趋势, 预示着HIV在湖北省的加快流行和进一步复杂化。