研究发现，细胞凋亡是神经管畸形(neural tube defects，NTDs)发生的重要机制之一^[1-4]。细胞凋亡发生过程中有明显的DNA损伤发生。而单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)能在单细胞水平上检测DNA链断裂。目前，SCGE被广泛用于生物监测等研究中，而有关其在胚胎神经细胞的DNA损伤中的应用报道较少。本文旨在探讨SCGE在检测神经管畸形胎鼠DNA损伤的应用并完善其在胚胎神经细胞中应用的注意事项，为NTDs的发生和相关干预的机制研究提供实验基础。

环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)；二甲基亚砜(北京化工厂)；胰酶、Triton X-100、普通熔点琼脂糖、低熔点琼脂糖及溴化乙啶等试剂(上海生物工程有限公司)。

DY-1电泳仪(北京市六一仪器厂)；OLYMPUS荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)。

健康雌性Wistar大鼠20只，体重250 g左右，未经产，鼠龄2.5～3个月(山西医科大学动物实验中心)。动物室温度20～23℃，湿度50％～55％，自然采光，自由摄食进水。雌雄大鼠适应性喂养3d后按1：1比例合笼，次日晨查阴栓，发现阴栓确定为受孕第0 d，并将孕鼠随机分为对照组和模型组。模型组大鼠于孕13 d时一次性腹腔注射环磷酰胺12.5 mg/(kg.bw)，正常对照组于孕13 d，给予0.3 ml的生理盐水。孕14 d时各组随机处死2只孕鼠，采用单细胞凝胶电泳技术检测胎鼠脑组织细胞DNA损伤。其余的孕鼠于孕20 d时处死，剖腹取胎鼠，计算胎鼠NTDs畸形发生率和生长发育指标。

采用单细胞凝胶电泳技术检测胚胎神经细胞的DNA损伤。

(1)消化：胎鼠脑组织置于预冷的解剖液中，解剖镜下剥去脑膜，剪碎后，于2 ml 37℃水浴中预热的0.25％的胰酶中准确消化15 min后立即用含有胎牛血清和马血清的DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)约4～5 ml终止消化。(2)离心、过滤：DMEM液体1 000 r/5min离心洗涤细胞共3次。最后一次洗涤后吸去上清，加入2 ml含血清的DMEM，将细胞吹散后用大于200目的不锈钢网过滤，记数后利用DMEM调整细胞的浓度为1×106。(3)观察细胞的存活状态：取约100 μl的细胞悬液，加少许台盼兰染色，光镜下观察细胞。活细胞透亮而死细胞则被染为蓝色，当观察细胞存活率达99％以上时，可以进行以下步骤。

将0.8％的正常熔点琼脂糖100μl滴在磨砂载玻片上，用盖玻片压平胶面，置4℃下固化10 min，然后轻轻移开盖玻片，此为第1层胶；取细胞悬液80 μl在37℃下与低熔点琼脂糖130 μl混匀后迅速铺在第一层胶上，用盖玻片压平胶面，置40℃下固化10 min，再轻轻移开盖玻片，此为第2层胶；然后在第2层胶上再铺上一层0.8％的低熔点琼脂糖70 μl，加上盖玻片，4℃下固化10 min，此为第3层胶。

移开盖玻片，将制好的胶板水平浸没于新配置的裂解液［NaCl(25 mol／L］，乙二胺四乙酸二钠盐(Na2EDTA，100 mmol/L)，pH=10，Tris-Cl(10 mmol/L))中。用之前加入1％的Triton X-100和10％的二甲基亚砜(DMSO)，4℃下裂解1 h。取出胶板，置于装有电泳缓冲液的水平电泳槽中，静置20 min解旋。

倒入新配置的电泳缓冲液［Na2EDTA(1 mmol／L)，pH=13NaOH(300 mmol/L)］，电压25V，调整电流为300 mA，4℃下电泳20 min。

将胶板取出，水平放入大平皿中，倒入中和液［pH=7.5，Tris-HCl(0.4mol/L)］，中和2次，每次15 min。20 μg/ml的溴化乙啶在暗处染色20 min，然后将胶板水平放置在蒸馏水中漂洗15 min，盖上盖玻片。4℃下湿盒中避光保存，尽快阅片。

在荧光显微镜下观察，绿光激发，吸收滤光片590 nm，高速SHD 400摄影和照相，彩色胶卷同步照相。选用彗星细胞发生率(％)和迁移距离估计DNA损伤程度。

表 1可见，模型组胎鼠畸形发生率明显高于正常对照组，且模型组胎鼠的体重、身长和尾长均明显低于对照组。说明在NTDs发生过程中胎鼠的生长发育受到影响。

表 1

表 1 各组胎鼠的体重、身长、尾长及畸形率(x±s)

表 1 各组胎鼠的体重、身长、尾长及畸形率(x±s)

正常对照组细胞呈现典型的圆形，而模型组细胞出现明显的拖尾现象即形成/ 彗星0样细胞, 且细胞迁移距离与彗星发生率均显著明显高于对照组。

图 1

图 1 SCGE法检测正常胎鼠和NTDs 胎鼠神经细胞的结果

结果可见，模型组细胞迁移距离与彗星发生率均［(16.35±5.59)μm,0.59%］，明显高于对照组［(7.28±1.76)μm,0.16%］，2组比较，差异有统计意义，P<0.05。

神经管畸形是由于神经管的发生和分化紊乱而导致的发生率高、后果严重的一组出生缺陷。环磷酰胺、是临床上常用的药物，其可引起细胞的凋亡^[5]而导致NTDs的发生。细胞凋亡时可见DNA的损伤，本研究利用单细胞凝胶电泳(SCGE)技术，以彗星细胞发生率、DNA迁移距离作为评价指标^[6-8]，灵敏、直观、简便的检测了CP导致的NTDs发生过程中的DNA损伤变化。结果显示，CP导致NTDs发生时细胞迁移距离与彗星发生率均显著高于对照组，并且NTDs胎鼠的体重、身长及尾长等生长发育指标明显低于对照组。

利用SCGE技术检测胎鼠脑组织神经细胞DNA的损伤时应注意以下事项，以保证结果的灵敏性和特异性：(1)单细胞悬液的浓度调整为1×106；(2)胶板制备时，胶的浓度可以选择在0.5％～1％之间，并要保证胶片表面的平滑；(3)裂解时加入1％的TritonX-100并加细胞保护剂肌氨酸钠或DMSO；(4)电泳时应保持电流、电压的恒定；(5)染色后在2 h内观察荧光效果最好。若不能及时观察可将载玻片盖上盖玻片后放于湿盒中4℃保存，72 h内阅片，防止荧光淬灭。