超声波是一种存在于生产和生活环境中的物理因素。目前，它已在工业生产、医学、生活等诸多领域中获得了广泛应用。低剂量脉冲超声波是一种使用频率和剂量较低的超声波，它采用脉冲式，其传递给组织的机械压能量-般＜3mg/cm²，不会引起组织致热效应，从而避免了以往治疗用超声波的致热不良副作用。本课题旨在研究低剂量脉冲超声波刺激对体外培养细胞的生物学效应。用不同条件下的低剂量脉冲超声波刺激体外培养细胞，采用5-溴脱氧尿苷(BrdU)掺入法观察研究细胞增殖效应情况，为合理利用超声波的生物学效应、防止不良作用提供科学依据。

DMEM干粉(美国GIBCO公司)100 g倒入1000 ml锥形瓶中，加双蒸水(ddH₂O)至850ml,混匀，使充分溶解，再加入L-谷氨酰胺292 mg(上海华美公司)、青霉素10万单位和链霉素100μg，用5.6% NaHCO₃调pH值，使之在7.0～7.2间，ddH₂O定容至1000 ml，玻棒搅拌混匀，抽滤除菌，分装到100 ml瓶中，4℃冰箱保存备用。

FCS(杭州四季青公司)常温融化后，经56℃水浴30 min灭活，分装到20ml瓶中，20℃冰箱保存备用。

含一定浓度FCS的DMEM培养液，一般为含10% FCS的DMEM培养液，现用现配。

称取胰蛋白酶(上海华美公司)2.5 g，用D-Hanks缓冲液溶解，玻棒搅拌混匀，放置4℃冰箱过夜后，用5.6%NaHCO₃调pH至7.4，定容至1000 ml，抽滤除菌，分装，-20℃冰箱保存备用。

称取DAB(美国DAKO公司)10 mg，用10 ml的DAB(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄·H₂O-NaCl)缓冲液溶解。

称取BrdU(英国Sigma公司)15.355mg，用10 ml ddH₂O溶解，配成5×10^-3mol/L的液体，过滤除菌，20℃冰箱保存备用。

用三羟甲基氨基甲烷-氯化钠-蛋白(TNB)缓冲液按200:1(v/v)稀释Anti-BrdU(美国DAKO公司)。

用TNB缓冲液按100:1(v/v)稀释Anti-mouse IgG HRP(美国DAKO公司)。

磷酸盐缓冲溶液(PBS)和D-Hanks缓冲液

三羟甲基氨基甲烷-氯化钠-吐温20(TNT)缓冲液；TNB(三羟甲基氨基甲烷-氯化钠-蛋白)缓冲液；甲酰胺溶液(柠檬酸三钠-甲酰胺ddH₂O)：Substrate intensify液(CoCl₂-NiCl₂-ddH₂O-H₂O₂) 。

人皮肤成纤维细胞(取自健康男童外科包皮环切手术时的包皮，约1.5 cm×1.5 cm大小)。

fracture healing system-model 2A型6孔培养板实验用低剂量脉冲超声波刺激仪(美国EXOGEN公司，固定频率和强度，德国乌尔姆大学赠送)。频率：1.5mHz，强度：30mW/cm²，重复频率：1 kHz。输出方式：脉冲式；脉宽：200μm。使用时，在输出末端涂上传导膏后贴在6孔培养板底部；CO₂培养箱(美国NUAIR公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；荧光显微镜(日本Nikon公司)；电热鼓风干燥箱(NC101-1A型)；超速离心机(80-1型)；电子天平(MA 110型)；酶标仪(S/N 5810型)。

将外科包皮环切手术切下的皮肤组织剪成0.1～0.5mm²左右大小的组织块，0.125%的胰蛋白酶消化30min，然后用含10% FCS的DMEM培养液终止消化，离心，弃上清。将组织块贴附于培养瓶内，翻转培养瓶，加少量培养液；2h后再轻轻把培养瓶翻转过来，使培养液慢慢浸没皮肤组织块。常规换液。1周后见皮肤组织块周围有细胞呈放射状长出。待细胞长满培养瓶，用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。

取出细胞冻存管，放入37℃水浴中，融化后离心1 000r/min，5min，用20% FCS的完全培养液接种细胞，密度2×10⁵/ml。

细胞培养液中FCS含量(v/v)为0%，0.5%，1%，5%及10%；超声波刺激时间为0，5，8，11，14及20min。

选对数生长期5代皮肤成纤维细胞消化，接种于6孔培养板中，密度为1×10⁵/ml，2m1/孔。细胞培养48h后，更换成含不同FCS浓度的培养液，用不同时间低剂量脉冲超声波刺激；继续培养6h，掺入BrdU(1×10^-5mol/L)，20μl/孔；继续培养18h后，弃培养液，用乙醇：冰乙酸(95:5，v/v)混合液固定，TNT缓冲液清洗，4℃，0.05 mol/L HCl孵育细胞20min；TNT缓冲液清洗，80℃水浴，甲酰胺溶液孵育细胞45min；TNT缓冲液清洗细胞；RT，FCS：TNB缓冲液(1:1，v/v)对细胞进行封闭2h；TNT缓冲液清洗细胞；抗-BrdU：TNB缓冲液(1:200，v/v)孵育细胞1h；TNT缓冲液清洗细胞；抗-鼠IgGHRP：TNB缓冲液(1:100，v/v)孵育细胞2h；TNT缓冲液清洗细胞；DAB染液(染色前在4ml DAB染液中加50μl substrate intensify液)染细胞10min；显微镜下计数BrdU阳性着色细胞(新增殖细胞核被染成黑色)。为防止系统误差，每剂量组各作3个平行孔，且每平行孔均计数1000中的BrdU阳性着色细胞数，取其均值。

采用SAS软件进行方差分析。

显微镜下观察，在不同条件的低剂量脉冲超声波刺激作用下，可见细胞均呈贴壁样生长。形状为梯形，胞质均一，胞内未见明显颗粒。如图 1中P所指就是经历过有丝分裂S期的细胞，已被BrdU结合；N所指的细胞没有发生有丝分裂，没被BrdU结合，故镜下只能看到P所指的细胞核，而不易观察到N所指的细胞核。实验结果显示，低剂量脉冲超声波刺激时间在0，3和8min时BrdU阳性着色细胞数量逐渐增多；而当刺激时间达20 min时，BrdU阳性着色细胞数量继续增多的并不明显，甚至开始出现减少。同时，细胞培养液的FCS含量不同，BrdU阳性着色细胞数量也不一样，FCS含量增加，BrdU阳性着色细胞数量呈增加趋势。

图 1

图 1 低剂量脉冲超声波刺激人皮肤成纤维细胞增殖( BrdU- 结合, 10×10)

(表 1) 细胞培养液分别含0%，5%和10% FCS，对照组不受低剂量脉冲超声波刺激。结果表明，在一定时间范围内随低剂量脉冲超声波刺激时间的增加，BrdU阳性着色细胞数量增多。细胞培养液的FCS含量增加，BrdU阳性着色细胞数量呈增加趋势。

表 1

表 1 不同条件低剂量脉冲超声波刺激BrdU阳性着色细胞(%, x ± s)

表 1 不同条件低剂量脉冲超声波刺激BrdU阳性着色细胞(%, x ± s)

BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷的类似物并能与之竞争性地参与细胞DNA合成^[1]。当细胞处于DNA合成期，如有BrdU存在会使其掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种存留将是永久的。BrdU标记和检测的准确性高，方法简便、迅速、安全，是反映细胞增殖的理想指标^[2]。该方法可以与流式细胞术互补，流式细胞术研究的结果主要反映细胞在一个细胞周期中各时相的某些改变，而BrdU掺入法可以纵向研究连续增殖细胞的增殖动态和增殖潜能^[3]。

本研究结果显示，低剂量脉冲超声波能刺激人皮肤成纤维细胞生长增殖，其增殖情况与此超声波的刺激时间以及细胞培养液的成分有关。在培养液不含小牛血清，即细胞在培养所必需的生长因子缺乏的环境下培养时仍能正常生长。受低剂量脉冲超声波刺激的各剂量组细胞的增殖水平较对照组细胞均有升高，其中细胞培养液不含FCS时，超声波刺激时间为8和14 min时，BrdU阳性着色细胞率与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01) ；而细胞培养液含10% FCS时，超声波刺激时间为5，8，11和14 min时，BrdU阳性着色细胞率与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01) 。且培养液FCS含量分别为0%，5%和10%时，BrdU阳性着色细胞率的高峰值均在低剂量脉冲超声波刺激时间为8～11 min时。可认定低剂量脉冲超声波刺激促进细胞增殖的最佳时间应在8～11 min。