研究表明，通过促进肿瘤细胞的凋亡对于肿瘤的治疗具有积极重要的意义。线粒体促凋亡蛋白Smac(the second mitochondria-derived activator of caspase)，又称DIABLO（direct IAP-binding protein with low pI），由Du于2000年发现^{[1, 2]}。为探讨Smac基因对肿瘤细胞凋亡的影响及其作用机制，以及探讨以Smac基因为基础的肿瘤基因治疗策略，本实验构建了含人全长型Smac基因的真核表达载体pcDNA3.1+-FL hSmac，并转染肝癌细胞株(SMMC-7721) 。现将结果报告如下。

人宫颈癌细胞株（Hela）、SMMC-7721为本室保存；胎牛血清、1640培养基（美国Gibco公司）；pcDNA3.1+真核表达载体、大肠埃希菌工程菌株DH5α为本室保存；lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）；Trizol（上海生工公司）；RT-PCR试剂盒（杭州博日公司）；pMD19T、限制性内切酶、DL2000 Marker（大连宝生物公司）；Smac兔多克隆抗体、β-actin兔多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；PCR引物合成（大连宝生物公司）；其他生化试剂为国产分析纯。TC-1 PCR扩增仪（美国Perkin-Elmer公司）；低温高速离心机（日本TOMY公司）；分光光度计（美国Beckman公司）；紫外凝胶检测和成像系统（美国Bio-Rad公司）。

Hela和SMMC-7721细胞以含10%胎牛血清的1640培养液，于37℃、5% CO₂ 培养箱中常规培养。

按Genbank中人Smac的cDNA全长序列（AF262240），利用引物设计软件oligo6.0设计引物。hSmac上游引物（forward primer）F1:5′-gctctagaatggcggctctgaagagttggctgt-3′，含XbaⅠ酶切位点；下游引物（reverse primer）R1:5′-gcggatcctcaatcctcacgcaggt-3′，含BamHⅠ酶切位点。

Hela细胞总RNA提取和RT-PCR分别按Trizol和转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒说明书进行，得到FL hSmac。

电泳、切胶回收PCR产物，与pMD19T载体16℃连接过夜，转化，筛选阳性克隆进行PCR、酶切以及DNA测序鉴定。

测序正确的pMD19T-FL hSmac，BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，回收FL hsmac片段；pcDNA3.1+用NheⅠ和BamHⅠ双酶切，回收载体片段。然后二者连接，转化，筛选阳性克隆进行鉴定。

转染前1 d用0.25%胰酶消化细胞，以1×10⁵个/孔接种于24孔板，至转染当天细胞达80%～90%。转染步骤按脂质体lipofectamine 2000说明书进行。以空载体转染为阴性对照。另设置转染pcDNA3.1+-EGFP组以通过荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率。

转染48 h后收获细胞，提RNA和蛋白质，采用RT-PCR、Western Blot法检测人Smac基因的表达，分别以β-actin和GAPDH为内参照。RT-PCR引物为：human smac上游：5′-tcagagcctcattccctt-3′，下游：5′-gtgattcctggcggttat-3′，扩增片段大小为372bp；β-actin上游：5′-aaatcgtgcgtgacattaa-3′，下游：5′-ctcgtcatactcctgcttg-3′，扩增片段大小为474 bp。Western Blot操作步骤参照文献^[3]。

采用SPSS 14.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析进行检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

FL hsmac基因PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后得到约730 bp的特异性条带，与引物设计时预测大小相一致。

图 1

注:1 :FL hSmac 基因的PCR 产物;2 :DL2000 Marker 。 图 1 RT- PCR扩增的人Smac 基因

hsmac PCR和酶切鉴定（图 2）

载体pMD19T-FL hsmac长度约为3.4 kb，以该载体为模板，F1和R1为引物进行PCR扩增，产物大小约为730 bp；EcoRⅠ单酶切此载体可得到2个片段，大小分别约为400和3000 bp。

图 2

注:1 :pMD19T - FL hsmac 质粒EcoR Ⅰ酶切;2 :pMD19T - FL hsmac PCR 产物;3 :pMD19T - FL hsmac 质粒;4 :DL2000 Marker 。 图 2 pMD19T- FL hsmac 载体的PCR、酶切鉴定

经Blast程序比对序列分析结果证实插入片段与预计插入序列具有100%同源性，即说明本研究已正确克隆了hSmac基因的CDs序列。

对重组真核表达载体pcDNA3.1+-FL hSmac分别进行PCR、酶切鉴定。重组载体：长度约为6.1kb，PCR可得到大小约730bp片段。采用SalⅠ单酶切得到大小为2185和3935 bp的2个片段；用ScaⅠ单酶切也得到2个片段，大小为1791和4329 bp；用BglⅡ和BamHⅠ双酶切仍得到2片段，大小分别为1609和4511 bp。酶切所得片段大小均与预计相符，证明重组真核表达载体pcDNA3.1+-FL hSmac构建正确。

质粒pcDNA3.1+-EGFP与脂质体以不同比例转染SMMC-7721细胞，转染48 h后收获细胞。流式细胞术检测结果表明质粒与脂质体的最适比例为1:2.5，此时细胞转染效率最高，达48%。转染pcDNA3.1+-EGFP的细胞在荧光显微镜下可观察非常明亮的绿色荧光，也说明转染有效。

重组载体pcDNA3.1+-FL hSmac瞬时转染SMMC-7721细胞48 h后，进行RT-PCR，结果发现在372 bp左右发现特异性条带，而且转染pcDNA3.1+-FL hSmac组的Smac表达明显增加。经统计学分析，Smac基因的表达在转染pcDNA3.1+-FL hSmac组与正常对照组、转染空载体组之间差异均有统计学意义（P＜0.01），说明转染有效。Western blot检测也显示，转染pcDNA3.1+-FL hSmac组smac蛋白表达明显高于正常对照组、转染空载体组，与RT-PCR结果一致。

Smac分为全长型（野生型）和成熟型。在凋亡刺激信号的作用下，野生型Smac蛋白发生裂解，释放成熟的多肽进入胞质中。成熟的Smac蛋白可特异地结合广泛存在于肿瘤细胞中的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs），解除了IAPs对caspase3、7、9的抑制，从而促进细胞凋亡。Smac还可与其它凋亡调节因子发生作用发挥其促凋亡活性，比如Bcl-2、Bax、P53^{[4, 5]}。Smac可以通过其N-或C-末端促进凋亡、影响细胞周期、增强肿瘤免疫等多方面机制来抵抗肿瘤。研究表明，高表达的Smac可促进肿瘤细胞凋亡，增加肿瘤细胞对放化疗的敏感性^{[6, 7]}。因此，利用Smac基因表达促进肿瘤细胞凋亡正成为抗肿瘤治疗的研究热点。

本实验根据Genbank中人Smac的cDNA全长序列（AF262240）设计引物，不仅使编码Smac的基因片断具有完整的开放读码框架以便表达；而且在引物5′端添加XbaI或BamHI酶切位点和2 个保护碱基以保证酶切反应的顺利进行。载体构建中，利用XbaI和NheI是同尾酶这一特点，成功地将目的基因片段重组到pcDNA3.1+中。结果显示，通过脂质体介导，构建的重组质粒成功地导入SMMC-7721中，Smac mRNA和蛋白表达均增加。这为后续研究Smac基因在肿瘤细胞凋亡过程中的调控作用，以及探讨以Smac基因为基础的肿瘤基因治疗策略提供了基础依据。