顺铂(cis-diamminedichloroplatinum，CDDP)是临床上常用的化疗药物，广泛地应用于各种实体瘤的治疗，但顺铂的严重肾毒性是限制其临床应用的主要因素。目前，顺铂所致肾毒性的机制尚不十分清楚。研究表明，顺铂能够破坏氧自由基代谢的平衡状态，从而引发氧化应激^[1]。硼是广泛存在于自然界的非金属元素，具有多种生理功能，如促进胚胎发育、参与能量底物的代谢、骨/矿物质代谢和炎症调解等^[2]。有研究发现，硼可以直接作用于γ谷氨酸转肽酶而使还原型谷胱甘肽(GSH)含量增加，而起到氧化剂清除的作用^[3]。因此，本研究采用人胚肾293(HEK293) 细胞体外观察硼酸(boric acid，BA)对顺铂肾毒性的保护作用，并探讨其可能作用机制。

顺铂(冶金部云南贵金属研究所)，纯度不低于96%，临用前以生理盐水配制；硼酸(德国Fluca公司)；胎牛血清培养液(DMEM)(美国GIBCO公司)；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)、Triton X-100、硫代巴比妥酸(TBA)、邻苯二醛(OPT)、DL-甲硫氨酸磺酞亚胺(BSO)(美国Sigma公司)；其他试剂均为分析纯。

HEK293细胞(中国协和医科大学)；培养基为含双抗(100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素)及10%胎牛血清的DMEM，于37℃、含5%CO₂的孵育培养箱中培养。取处于指数生长期的细胞用于实验。

采用MTT比色法^[4]测定硼酸对顺铂细胞毒性的保护作用。将100 μl(1×10⁵个/ml)HEK293细胞接种到96孔板中，待细胞生长至融合状态时，加入硼酸(0.1 mmol/L)预处理24 h，再加入不同浓度的顺铂(0，0.13，0.25，0.50和1.00 mmol/L)，在37℃，含5%CO₂的孵育箱内培养24 h后，向培养基中加入MTT，终浓度为0.5 g/L，37℃放置4 h后，弃上清并加入溶解液(50%二甲基甲酰胺，20%十二烷基硫酸钠)，4 h后用酶标仪检测(595 nm对635 nm)吸光度(A)值。细胞存活率的计算方法为：细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。

参考文献^[5]，将HEK293细胞(5×10⁴个)接种到12孔板中，待细胞生长至融合状态时，加入硼酸(0.1 mmol/L)预处理24 h，再加入不同浓度的顺铂(0，0.06，0.13和0.25 mmol/L)，在37℃，含5%CO₂的孵育箱内培养16 h后，用Triton X-100裂解细胞，取250 μl到试管中，37℃孵育1 h，加入400 μl 35%高氯酸，5 000 g离心10 min，取上清600μl加入200 μl的1.2%硫代巴比妥酸，沸水浴中煮沸30 min，冷却后，酶标仪535 nm处测定硫代巴比妥酸的产物(TBARS)。

参考文献^[6]将HEK293细胞(2×10⁵个)接种到6孔板中，待细胞生长至融合状态时，加入硼酸(0.1 mmol/L)或BSO(80 μmol/L)预处理24 h，再加入不同浓度的顺铂(0，0.06，0.13和0.25 mmol/L)，在37℃、含5%CO₂的孵育箱内培养16 h后收集细胞，加入0.4 ml 5%三氯乙酸，4℃孵育30 min，取50 μl孵育液加到1 ml 1 mg/ml的OPT溶液中，37℃暗处孵育15 min，用荧光比色计测定荧光强度，激发波长为485 nm，发射波长为550 nm，狭缝4 nm。

采用SPSS 11.5软件进行统计分析。应用多功能半数致死量软件2.1版(SUN YAT-SEN Uiversity of Medical Sciences)Bliss法计算半数抑制浓度(IC₅₀) 。

图 1可见，MTT法测定顺铂对HEK293细胞的细胞毒性作用，随顺铂浓度的增加，细胞存活率逐渐下降，呈明显的剂量依赖关系，24 h的IC₅₀值为(0.38±0.04) mmol/L。

图 1

注: 与空白对照组比较, a P ＜ 0.05, b P ＜ 0.01; 与相同浓度顺铂组比较, c P ＜ 0.05。 图 1 硼酸对顺铂HEK293 细胞细胞毒性的影响

硼酸(0.1 mmol/L)预处理24 h后，再加入顺铂，观察硼酸对顺铂细胞毒性的影响。结果显示，硼酸能降低顺铂对HEK293细胞生长的抑制作用，24 h的IC₅₀值为(0.87±0.10) mmol/L，比单独顺铂组的IC₅₀值显著升高(P＜0.05) ，表明硼酸对顺铂细胞毒性有抑制作用。

顺铂作用于HEK293细胞16 h后，细胞内TBARS显著增加(P＜0.05或P＜0.01) ，呈剂量依赖关系。硼酸预处理24 h后，再与不同浓度的顺铂温育16 h，细胞的TBARS水平显著低于单独顺铂组(P＜0.05) ，表明硼酸能抑制顺铂诱导TBARS生成，具有抗氧化作用。

图 2

注: 与空白对照组比较, a P ＜ 0.05, b P ＜ 0.01; 与相同浓度顺铂组比较, c P ＜ 0.05。 图 2 硼酸对顺铂产生脂质过氧化产物的影响

结果显示，顺铂作用于HEK293细胞16 h后，细胞内GSH含量显著下降(P＜0.05或P＜0.01) ，并呈剂量依赖关系；硼酸预处理24 h后，再与不同浓度的顺铂温育16 h，细胞的GSH含量显著高于单独的顺铂组(P＜0.05) ；BSO预处理24 h后，再与不同浓度的顺铂温育16h，细胞的GSH含量显著低于单独顺铂组(P＜0.05) 。

图 3

注: 与空白对照组比较, a P ＜ 0.05, b P ＜ 0.01; 与相同浓度顺铂组比较, c P ＜ 0.05。 图 3 硼酸及BSO对顺铂引起的GSH 含量降低的影响

顺铂进入体内可产生大量羟自由基和活性氧自由基^[7]，氧化性损伤是顺铂引起肾损害的主要原因^[8]。本研究中顺铂组TBARS水平与对照组相比明显升高，硼酸能明显降低顺铂引起的HEK293细胞的TBARS水平，表明硼酸对顺铂肾毒性的保护作用机制可能在于抑制顺铂引起的脂质过氧化。

GSH是细胞内的主要抗氧化防御系统，肾小管上皮细胞具有极强的合成与分解GSH的酶以及介导完整的GSH三肽转运的膜运输蛋白的活性^[9]，所以肾脏对GSH的利用能力在细胞抵抗各种化学毒物损伤上起着重要作用^[10]。本研究发现，顺铂能引起HEK293细胞的GSH含量下降，BSO可增强顺铂的GSH水平下降，硼酸则抑制顺铂引起的GSH含量下降。结果表明：顺铂的肾毒性与GSH耗竭有关，硼酸对顺铂肾毒性的保护作用机制可能是抑制顺铂引起的GSH耗竭，从而抑制了顺铂引起的脂质过氧化。

本研究的意义在于不但发现了硼酸对顺铂肾毒性的保护作用，而且初步探明了其抗氧化的保护机制，为硼酸的抗氧化应用提供了理论依据。