近年来，由于抗结核药、β内酰胺类抗生素等广泛使用，临床上出现越来越多的耐药及复发肺结核病人，而结核病患者L型结核分支杆菌(MTB-L)是结核病难治、易复发及耐药的主要原因之一^{[1, 2]}。因此，加强对MTB-L的检测是研究热点。国外BACTEC9000检测系统价格昂贵，且有放射污染，基层医疗单位难以承受^[3]。国内庄玉辉教授^[4]研制的改良固体培养基(TSA-L)耗时较长，需4～5周才能出现结果。本研究结合固、液培养基的特点，研制一种新型L型固、液双相培养基(LBCM)，在MTB-L快速培养和涂阴肺结核病诊断中取得满意的结果。现报告如下。

1 材料与方法 1.1 标本来源

130份涂阴痰液标本采自2005年7月～2006年12月我中心门诊肺结核病人，其中初治涂阴88例，复治涂阴42例。

1.2 培养基

L型液体培养基(92-3TBL)(蚌埠医学院微生物学教研室)。L固体培养基(TSA-L)(南京普朗集团有限公司)。LBCM(本实验室自制)，按文献^[5]加以改良，取过滤后的天然椰子汁160 ml，人血浆40 ml，甘油10 ml，牛肉汤40 ml，蔗糖50 g，将配制好的混合液再过滤，分别分装于无菌三角烧瓶中。每天进行1次巴氏消毒，共3次，置入血清凝固器中30 min，待冷，吸取2～3 ml混合液加入TSA-L中，加液量以培养基倾斜15°角刚好覆盖斜面为基准，待用。

1.3 培养方法及结果判断 1.3.1 痰液标本前处理

采用酸碱中和法，按文献^[6]进行。无菌晨痰2～3 ml，加入0.25%酚红指示剂0.1 ml，再加入1～2倍体积4%NaOH置37℃水浴箱消化15 min，并不时用滴管吹取混匀，随时滴加1 mol/L HCl中和至中性(无色)，3 000 r/min离心20 min，分别取沉淀物0.3 ml接种于LBCM、92-3TBL、TSA-L 3种培养基上，并设阴性对照。LBCM接种后倾斜15°角放置，37℃5 d后直立继续培养，每3 d观察1次，至8周止。92-3TBL、TSA-L培养参照文献^[7]进行。

1.3.2 抗酸染色法IK

按文献^[6]进行，挑去培养物涂片经自然干燥后加石炭酸复红置湿盒中于室温染色过夜，次日用0.5%盐酸酒精脱色，再以美兰染色1 min，倾去染料无需冲洗即可镜检。菌体显红色为MTB-L阳性。

1.3.3 结果判断

LBCM、TSA-L培养基以斜面长出油煎蛋状菌落或颗粒型(G)菌落，并涂片证实后判为阳性。92-3TBL离心后取沉渣染色镜检即可。

1.4 统计分析

采用PEMS3.1软件进行分析，计数资料用χ²检验。

2 结果 2.1 130例涂阴标本在3种培养基上培养情况(表 1)

结果显示，LBCM、92-3TBL、TSA-L 3种培养基对涂阴标本肺结核病人分离率分别为38.5%，36.9%，36.2%。3种方法比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。LBCM阳性结果出现的平均时间比TSA-L短，2组比较差异有统计学意义(t＝30.07，P＜0.01)；与92-3TBL培养时间比较差异无统计学意义(t＝0.3915，P＞0.05)。

2.2 LBCM法对初治、复治病人的分离情况

结果表明，LBCM法对初治病人检出率12.5%(11/88)；复治病人检出率92.9%(39/42)，复治病人MTB-L阳性率明显高于初治病人，经统计学分析，差异有统计学意义(χ²＝77.56，P＜0.01)。

3 讨论

在130份涂阴病例中，LBCM与92-3TBL、TSA-L 3种培养基的阳性率分别为38.5%，36.9%，36.2%。阳性结果出现的平均时间LBCM法比TSA-L法培养提早15.1 d，提示LBCM法是集液体和固体培养法优点于一体，具有快速、准确、及时分纯的特点，且有较好的灵敏度。LBCM法对初治病人检出率为12.5%，复治病人检出率为92.9%。结果显示，复治病人MTB-L检出率远高于初治病人，该法对涂阴病例总检出率为38.5%。文献报道^[5]，常规改良罗氏培养法对涂阴病例培养结核分支杆菌的阳性率仅为2.6%，因此，加强对MTB-L的检测，尤其对涂阴肺结核病人，对减少误诊和漏诊，提高结核病的诊断正确率具有重要价值。