产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)细菌的临床分离率逐年升高，研究发现,产ESBLs细菌不但对β-内酰胺类抗生素高度耐药。而且对氨基糖苷类抗生素的耐药率也明显高于非产ESBLs菌株^[1]。产生ESBLs和氨基糖苷修饰酶（aminoglycoside modifying enzymes，AMEs）分别是细菌对β-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素耐药的主要原因。为了解二者的联合分布特征和耐药机制，本研究对49株产ESBLs大肠埃希菌的耐药表型及ESBLs与AMEs基因的流行状况进行了分析。结果报告如下。

（1）菌株：49株产ESBLs大肠埃希菌于2006年10～12月间分离自海南省人民医院儿科、重症监护(ICU)科、呼吸科、神经外科和肾内科等病房住院患者。标本种类主要包括痰液、粪便、尿液、咽拭子和分泌物等。常规方法分离鉴定并保存。所有菌株经检测均为ESBLs阳性。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922a，大肠埃希菌ATCC 35218、肺炎克雷伯菌ATCC700603。（2）主要试剂与仪器：药敏纸片（英国Oxiod公司）；脱氧核苷三磷酸(dNTP)、Taq DNA聚合酶等分子生物学试剂[TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司]；GeneASystem 2700PCR扩增仪（美国PE公司）；DY-WZ电泳仪（北京市六一仪器厂）；紫外凝胶成像系统（美国Kodak公司）。（3）PCR引物：根据GenBank公布的各型ESBLS基因和AMEs基因序列设计引物，由TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司合成。各型基因引物序列、退火温度及目的片段长度如下：引物bla_TEM：退火温度55℃，片段长度861 bp；引物bla_SHV：退火温度55℃，片段长度867 bp；引物bla_CTX-M-1组（包括CTX-M-1,-3,-10,-12,-15,-22,-23,-28）：退火温度55℃，片段长度780 bp；引物bla_CTX-M-2组（包括CTX-M-2,-4,-5,-6,-7,-20; Toho-1）：退火温度55℃，片段长度865 bp；引物bla_CTX-M-9组（包括CTX-M-9,-13,-14,-16,-17,-19,-21,-27;Toho-2）：退火温度55℃，片段长度870 bp；引物blaPER-1：退火温度47℃，片段长度933 bp；引物blaVEB-1：退火温度57℃，片段长度642 bp；引物aac(3)-Ⅱ：退火温度57℃，片段长度408 bp；引物aac(6′)-I：退火温度57℃，片段长度394 bp；ant(3″)-I：退火温度59℃，片段长度350 bp。

采用K-B(Kirby-Bauer)纸片扩散法检测细菌对氨苄西林（AMP）、头孢唑啉（CFZ）、头孢哌酮（CFP）、头孢噻肟（CTX）、头孢曲松（CRO）、头孢他啶（CAZ）、头孢吡肟（FEP）、氨曲南（ATM）、氨苄西林/舒巴坦（AMS）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP）、美洛培南（MEM）、妥布霉素（TOB）、庆大霉素（GEN）、阿米卡星（AMK）、环丙沙星（CIP）、复方新诺明（SXT）16种抗生素的敏感性。根据美国临床实验室标准化委员会（CLSI /NCCLS）2005年标准^[2]判断敏感(S)、中介(I)和耐药(R)。

反应体系分别为引物(100 pmol/L)各0.8μl，dNTP(各2.5mmol/L)各2.4μl，PCR buffer(含Mg²⁺1.5mmol/L)各3.0μl，TaqDNA 聚合酶(5U/μl)0.25μl，总体积为30μl，其中模板液(10ng/μl)1.0μl。热循环参数为94℃预变性5min，94℃变性30s→退火30s→72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸15min。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml溴乙锭）电泳后紫外灯下观察结果，并照相保存。

所有菌株全部为对3种或3种以上不同种类抗生素耐药的耐多药菌株；对第1代头孢菌素(氨苄西林)、第2代头孢菌素（头孢唑啉、头孢呋辛）、部分第3代头孢菌素（如头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松）及氨苄西林/舒巴坦的耐药率均超过90%；对头孢他啶的耐药率相对较低，为44.9%；对第4代头孢菌素头孢吡肟的耐药率也达到了32.7%；对氨基糖苷类抗生素如妥布霉素、庆大霉素的耐药率均超过60%；对美洛培南耐药率最低，仅为2.0%。

图 1可见，除引物bla_CTX-M-2、blaPER、blaVEB基因未见阳性扩增结果外，bla_TEM、bla_SHV、bla_CTX-M-1、bla_CTX-M-9基因均出现阳性扩增结果。bla_TEM阳性率最高，达93.9%（46/49），其次分别为bla_CTX-M-9、bla_CTX-M-1和bla_SHV，阳性率分别为59.2%（29/49），22.5%（11/49）和12.2%（6/49）。有37株同时存在2种或2种以上β-内酰胺酶基因型，以bla_CTX-M-9组与bla_TEM共存最为常见，计29株。

图 1

注：1～3:blaTEM；4～6:blaSHV；7～9:blaCTX-M-1；10～12:blaCTX-M-9；M:DL 2000 marker。 图 1 ESBLs基因PCR产物电泳图

49株产ESBLs大肠埃希菌中，有37株AMEs基因PCR扩增阳性，阳性率为75.5%，其中aac(3)-Ⅱ阳性率最高，为61.2%（30/49），其次为aac(6′) -I和ant(3″)-I ，阳性率分别为30.6%（15/49）和18.4%（9/49）。有13株同时存在2种或2种以上基因型，以aac(3)-Ⅱ与aac(6′) -I基因共存最为常见，计12株。

图 2

注：M:DL2000 marker；1:阴性对照；2～3:分离株。 图 2 AMEs基因PCR产物电泳图

49株产ESBLs菌株中有37株在携带ESBLs基因的同时又携带有一种或一种以上的AMEs基因，2类基因联合检出情况较为普遍。其中，以aac(3)-Ⅱ＋bla_TEM＋bla_CTX-M-9联合检出最为常见（8/49），其次分别为aac(3)-Ⅱ＋bla_TEM（5/49）,aac(3)-Ⅱ＋bla_TEM＋bla_CTX-M-1（3/49）,ant(3″)-I＋bla_TEM＋bla_CTX-M-9（3/49）和aac(3)-Ⅱ＋aac(6′) -I＋bla_TEM＋bla_CTX-M-9＋bla_CTX-M-1（3/49）。

产ESBLs细菌耐多药状况严重，除对β-内酰胺类抗生素高度耐药外，对氨基糖苷类抗生素的耐药现象也普遍存在^{[1, 3]}。氨基糖苷类与β-内酰胺类抗生素联合使用是临床上最常见的治疗革兰阴性菌感染的经验用药方式之一，但是产ESBLs菌株对氨基糖苷类抗生素的高水平耐药常常预示着联合用药协同效应的消失^[4]。本研究应用PCR方法同时检测分析产ESBLs大肠埃希菌中ESBLs基因以及AMEs基因存在状况、基因型分布特征及联合检出情况。结果显示，所有产酶株全部检出ESBLs基因，其中bla_TEM阳性率最高，其次分别为bla_CTX-M-9、bla_CTX-M-1和bla_SHV，未检出bla_CTX-M-2、blaPER和blaVEB。值得提出的是，CTX-M型ESBLs累计检出率达到了81.63%，仅次于TEM型，且尤以CTX-M-9组基因型最为常见。药敏结果显示，对头孢噻肟、头孢曲松的耐药率明显高于头孢他啶。氨基糖苷修饰酶（AMEs）尤其是由质粒所编码的AMEs是细菌对氨基糖苷类抗生素耐药的主要原因。不同种类的AMEs对抗生素的修饰谱不同，一种药物能被一种或多种酶修饰，几种不同的氨基糖苷药物也能被同一种酶所修饰^{[5, 6]}。而且，不同地域不同种属的细菌AMEs的分布特征也不尽相同。本研究结果显示，海南省产ESBLs大肠埃希菌中AMEs基因的携带率达75.5%，阳性率最高的是aac(3)-Ⅱ，达61.22%，其次分别为aac(6′) -I和ant(3″)-I。而且大多数菌株同时检出2种或3种AMEs，最常见的组合方式为aac(3)-Ⅱ＋aac(6′) -I，仅有少数菌株检测到单一AMEs。这一结果与我国孔海深等报道一致^[7]，与徐红星等报道略有不同^[8]，可能由于不同医院用药种类不同所致。

通过对2类酶基因的联合检出状况分析发现，一些产ESBLs菌株在携带有多种β-内酰胺酶基因的同时又携带2种或2种以上的氨基糖苷类修饰酶基因，bla_TEM＋bla_CTX-M-9＋aac(3)-Ⅱ是最常见的共存方式。这种复杂的产酶状况导致了临床菌株复杂多样的耐药表型，给抗感染治疗带来极大困难。目前，CTX-M型ESBLs已在世界范围内广泛传播^[9]。有研究报道，blaCTX-M和AMEs基因可位于同一个整合子上，或一个可接合性的耐药质粒上，临床上抗生素联合应用的选择性压力促进了这些多重耐药遗传片段的持续及广泛传播，导致细菌对β-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素的联合耐药^{[10, 11]}。 本文结果提示，通过对产ESBLs细菌β-内酰胺酶和氨基糖苷修饰酶基因的流行病学研究，掌握其基因型分布特征，有助于及时准确地判断细菌对β-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素的耐药性，指导临床医生合理应用抗生素、延缓细菌耐药性的产生。