乙酰甲胺磷(acephate) 化学名称为O,S-二甲苯-N-乙酰基硫代磷酰酸酯,是一种高毒农药甲胺磷的乙酰基衍生物，以高效、低毒、低残留而优于众多有机磷杀虫剂，可作为替代高毒农药的产品^[1]。国外有报道，乙酰甲胺磷对雄性小鼠的生殖系统具有毒性作用，可致小鼠精子数量减少和精子运动能力下降^[2]。本文旨在探讨不同剂量乙酰甲胺磷暴露对雄性大鼠的生殖毒性作用。

1 材料与方法 1.1 实验动物

清洁级成年SD雄性大鼠30只，体重180～220 g(宁夏医学院实验动物中心)。

1.2 受试物

市售浓度为30％的乙酰甲胺磷农药(湖北沙隆达股份有限公司)。

1.3 实验动物分组与染毒

将30只清洁级成年SD雄性大鼠随机分为5组，每组6只。根据生殖毒性研究中染毒剂量设计的原则，实验组以乙酰甲胺磷致大鼠半数致死量(LD50)为依据，设高(47.25 mg/(kg·bw)、中(23.63 mg/(kg·bw)、低(11.81 mg/(kg·bw)3个不同剂量的乙酰甲胺磷染毒组、1个阴性对照组和1个阳性对照组。染毒组大鼠用蒸馏水稀释配制的乙酰甲胺磷灌胃，阴性对照组大鼠用等量的蒸馏水灌胃，每天染毒1次，每周连续染毒5 d(周一～周五)，共染毒60 d；阳性对照组大鼠给予环磷酰胺20 mg/(kg·bw)，腹腔注射染毒，每天染毒1次。连续染毒5 d。实验期间，大鼠自由饮水，进食。 于大鼠末次染毒24h后通过心脏采血处死大鼠，取出双侧的睾丸及附睾组织进行指标检测。

1.4 观察指标及测定方法

(1)睾丸、附睾脏器系数的测定：处死大鼠后，立即取出其双侧睾丸及附睾，剥离周围脂肪组织和结缔组织，准确称量睾丸和附睾的重量，计算睾丸及附睾的脏器系数。(2)精子活率的测定：将一侧附睾在盛有生理盐水的培养皿中剪碎，制备精子悬液。取混匀的精子悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片于显微镜下观察精子活动力。按WHO推荐方法检测精子活率^[3]。(3)精子计数：参照文献^[4]方法，采用血细胞计数法计数上述精子悬液中的精子数，并换算为每克附睾精子数。(4)精子形态学观察：参照文献^[5]方法进行。(5)睾丸及附睾组织形态病理改变的检测：取大鼠另一侧睾丸和附睾组织，经10％中性甲醛固定。固定好的标本用梯度浓度的乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，切片厚5～8 μm，苏木精伊红(HE)染色。

1.5 统计分析

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。精子活率、精子畸形呈现泊松分布，因此精子活率和畸形率统计时先进行平方根反正弦变换(sin^-1$\sqrt{p}$)，使之转变为或接近正态分布再方差分析；大鼠体重增长量、睾丸和附睾脏器系数及精子数量的组间比较采用方差分析；剂量反应关系采用秩相关。

2 结果 2.1 一般情况

染毒初期，高剂量染毒组大鼠出现震颤、大小便失禁等轻微的中毒症状，并在染毒后2 h内逐渐消失。其他组别大鼠无明显中毒症状。

2.2 乙酰甲胺磷对大鼠体重、睾丸及附睾脏器系数的影响(表 1)

乙酰甲胺磷各染毒组大鼠体重增长量、睾丸和附睾脏器系数与阴性对照组相比，差异无统计学意义(P<0.05)。

2.3 乙酰甲胺磷对大鼠精子参数的影响 2.3.1 乙酰甲胺磷对大鼠精子数量及活率的影响(表 2)

各染毒组大鼠的精子数量均低于阴性对照组。与阴性对照组相比，中、高剂量染毒组大鼠的精子数量下降，差异有统计学意义(P<0.01)，呈现剂量-效应关系(r=-0.642，P<0.01)；各染毒组大鼠精子活率均低于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，呈现剂量-效应关系(r=-0.866，P<0.01)。

2.3.2 乙酰甲胺磷对大鼠精子形态的影响

阴性对照组，低、中、高剂量染毒组精子畸形依次为：2.17±0.41，5.58±1.53，7.08±1.80，9.90±1.78，各染毒组精子畸形率均高于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，呈现剂量-效应关系(r=0.893，P<0.01)。高剂量染毒组精子畸形以头部畸形为主，低剂量染毒组精子畸形以尾部畸形为主。

2.4 乙酰甲胺磷对大鼠睾丸及附睾组织形态的影响

在光学显微镜下观察可见：阴性对照组大鼠的睾丸组织切片中曲精管排列规则，曲细精管由多层生精细胞和支持细胞组成，有5～8层细胞，从基底部到管腔各层生精细胞依次为精原细胞、精母细胞、圆形精子细胞、长形精子细胞和精子等，支持细胞位于生精细胞之间，细胞排列致密而规则，乙酰甲胺磷中剂量染毒组大鼠睾丸组织切片中多数生精小管管腔内有脱落的各级生精细胞，乙酰甲胺磷高剂量染毒组大鼠睾丸组织切片中许多生精小管生精细胞层数和各级生精细胞数量均减少，细胞排列疏松紊乱，管腔内成熟精子数量减少。部分生精小管塌陷、萎缩。阴性对照组大鼠附睾管上皮腔面平整，平滑肌丰厚，腔内充满精子；乙酰甲胺磷各染毒组大鼠附睾切片未见明显组织病理学变化。

3 讨论

本次研究发现，乙酰甲胺磷各染毒组大鼠的体重增长量、睾丸及附睾脏器系数与阴性对照组相比，差异无统计学意义；而各染毒组大鼠的精子数量、活率均显著低于阴性对照组(P<0.05)并呈现剂量-效应关系。足够的精子数量和适当的运动能力是雄性大鼠生殖能力的重要保障^[6]。精子数量的减少、活动能力的降低将导致雄性大鼠生育力下降，甚至不育。提示乙酰甲胺磷对雄性生殖功能影响主要是精子的生成和活动能力下降。

乙酰甲胺磷各染毒组的精子畸形率均显著高于阴性对照组(P<0.01)，且高剂量组以头部畸形为主，低剂量组以尾部畸形为主。提示乙酰甲胺磷对雄性大鼠具有生殖毒性作用。精子形态的改变反映雄性生殖细胞的遗传损伤^[7]，遗传物质主要集中在精子头部，头部畸形会造成流产、早产、子代畸形及遗传性疾病；精子的运动装置主要位于尾部，尾部畸形影响精子的活动能力，导致不育。

睾丸是精子生长的部位，附睾是精子成熟的部位，睾丸和附睾内的微环境对于精子生长、发育和成熟以及功能完成至关重要^[8]。本次研究发现，乙酰甲胺磷可引起睾丸组织病理学改变，提示乙酰甲胺磷可损伤睾丸组织结构，影响精子的质量。