2008, Vol. 24
2. 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所
缺铁性贫血与维生素A(VA)缺乏有关[1, 2]，贫血与VA缺乏往往同时存在，补铁同时加VA干预较单独补铁能更有效地纠正贫血。本文研究VA缺乏对大鼠铁营养状况的影响及VA缺乏对大鼠肝脏转铁蛋白受体(TfR)mRNA表达的影响，旨在为VA缺乏如何导致贫血及预防、治疗VA和铁缺乏提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 材料维生素A标准品，纯度95％以上(美国Sigma公司)；实验动物(上海斯莱克实验动物有限责任公司)；血红蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所)；血清铁蛋白、血清转铁蛋白受体ELISA试剂盒(美国Adlitteram Diagnostic Laboratories公司)；总RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒(美国Promega公司)；PCR试剂TaKaRa Taq DNA Polymerase Kit(大连宝生物工程有限公司)；引物(上海英骏生物技术有限公司)。
1.2 实验动物分组及饲养清洁级雄性SD大鼠52只，21日龄，在实验室适应1周后，按体重随机分为4组，每组13只。在生长期啮齿类动物纯化饲料配方(AIN-93G)的基础上，调整了维生素A和铁含量，使各组饲料中铁和维生素A水平如下：Ⅰ组Fe：35mg/kg饲料，VA：1200μg/kg饲料；Ⅱ组Fe：35mg/kg饲料，VA 0μg/kg饲料；Ⅲ组Fe：35mg/kg饲料，VA：120μg/kg饲料；Ⅳ组Fe：15mg/kg饲料，VA：120μg/kg饲料。单笼喂养，所有动物均自由进食及饮用蒸馏水，温度19～25℃，湿度55%～65％，每日光照12h，每天记录摄食量，并观察动物的一般状态，每周称体重1次，实验期为8周。实验结束后处死动物，腹主动脉采血，分离肝脏、脾脏。
1.3 检测指标血清维生素A测定采用高效液相色谱法；血清铁测定采用火焰原子吸收法；血红蛋白测定采用氰化高铁血红蛋白法；血清转蛋白受体、血清铁蛋白采用酶联免疫吸附法测定；肝铁含量、脾铁含量采用火焰原子吸收法测定。
1.4 转铁蛋白受体mRNA测定逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法。取各组动物肝脏同一部位，参照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，并测定RNA浓度。取1μg总RNA逆转录合成cDNA第一链，取4μl逆转录体系的eDNA作为摸板，加引物25pmo1、Taq聚合酶0.625U及相应缓冲液于25μl体系内进行PCR扩增，内参照β-actin。引物序列如下：TfR的上游引物5′-ACATGGACAGGAATACGTTC-3′，下游引物5′-CAATCGGATGCTTTACGTCC-3′；内参照β-actin上游引物5′-GTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3′下游引物5′-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3′，TfR和β-actin目标基因长度分别为512和708bp。PCR条件为94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，转铁蛋白受体循环35个周期，β-actin循环35个周期。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在凝胶图像分析系统上扫描，计算转铁蛋白受体产物的密度值与β-actin的密度值之比。
1.5 统计分析采用SPSS 13.0统计软件处理数据，4组间比较采用方差分析。
2 结果 2.1 各组动物体重及摄食量情况各组间大鼠的初始和终末体重差异均无统计学意义(P>0.05)；实验期内各组动物的平均摄食量差异无统计学意义(P>0.05)，说明本实验条件对大鼠体重及摄食量无不良影响，动物生长状况良好。
2.2 各组动物血清维生素A、血红蛋白(Hb)、血清铁水平(表 1)Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组血清VA水平显著低于Ⅰ组(P<0.05)，Ⅱ组VA水平显著低于Ⅲ组、Ⅳ组(P<0.05)，而Ⅲ组，Ⅳ组VA水平差异无统计学意义(P>0.05)。各组动物血红蛋白，Ⅳ组，Ⅱ组与Ⅰ组比较有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。对于血清铁，Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组血清铁显著低于Ⅰ组(P<0.05)，Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组之间差异无统计学意义(P>0.05)。可见，维生素A缺乏可使血清铁下降，但对血红蛋白未造成影响。
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表 1 各组动物血清VA、Hb血清铁水平比较（x±s,n=13） |
2.3 各组动物血清转铁蛋白受体(TfR)、铁蛋白(Fn)水平(表 2)
血清转铁蛋白受体，Ⅱ组、Ⅲ组 Ⅳ组显着高于Ⅰ组(P<0.05)，Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组之间差异无统计学意义(P>0.05)。血清铁蛋白，Ⅱ组与Ⅲ组显著低于Ⅰ组(P<0.05)，Ⅳ组与Ⅰ组比较差异无统计学意义(P>0.05)。可见，血清维生素A缺乏可以提高血清转铁蛋白受体水平和降低血清铁蛋白水平。
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表 2 各组动物血清TfR、Fn水平比较（x±s,n=3,µg/L） |
2.4 各组动物脏器湿重及铁含量情况(表 3)
各组肝脏、脾脏湿重差异无统计学意义(P>0.05)；各组肝脏铁含量与对照组Ⅰ组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，Ⅱ组、Ⅲ组与Ⅰ组比较有增加，趋势；脾脏铁含量Ⅱ组、Ⅲ组与Ⅰ组比较增加且差异有统计学意义(P<0.05)，可见，维生素A缺乏使脾脏铁含量增加。
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表 3 各组动物脏器湿重及铁含量比较（x±s,n=13） |
2.5 各组大鼠肝脏转铁蛋白受体mRNA表达情况(图 1)
Ⅰ组转铁蛋白受体mRNA的表达最低，同时从Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组可以看出，转铁蛋白受体mRNA表达增强。可见，维生A缺乏可以使大鼠肝脏转铁蛋白受体mRNA的表达增强。
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图 1 大鼠肝脏转铁蛋白受体mRNA的表达 |
3 讨论
维生素A缺乏可能通过以下3种途径导致贫血：(1)调节红细胞生成；(2)调节对感染性疾病或感染性贫血的免疫力；(3)调节铁代谢。这些机制可能交错影响，但核心是调节铁代谢[3]。本实验中VA缺乏没有对大鼠体重和摄食量产生影响，这可能与实验期比较短有关。
吸收进入体内的铁与血浆转铁蛋白(Tf)结合转运到各组织。如果机体铁储备丰富，铁会以铁蛋白和含铁血黄素形式储存于肝脏、脾脏：如果机体缺铁或对铁的需求增加时，再由Tf介导运往需铁组织[4]。VA缺乏可导致铁释放障碍，使铁滞留在储铁器官中，补充维生素A可以促进肝脏、脾脏等器官对铁的利用[5]。本文结果显示，VA缺乏时，脾铁含量增加，肝铁含量有增加趋势，提示VA缺乏时铁滞留在储铁器官，铁由储铁组织向外周需铁组织转运发生障碍，与文献报道一致。
本实验中，VA缺乏大鼠肝脏TfR mRNA的表达增强。TfR的表达经铁调节蛋白(IRP)在转录后水平调节，当细胞内铁缺乏时，TfR mRNA3′端非翻译区的铁反应元件(IRE)与IRP亲和力增强，可抑制TfR mRNA的降解，使TfR表达增加；当细胞内铁过剩时，IRE与IRP亲和力下降，TfR mRNA的降解增加，使TfR表达减少[6]。VA缺乏可能通过影响IRE-IRP结合活性使大鼠肝脏转铁蛋白受体mRNA的表达水平提高，其机制还需进一步研究。
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