抗菌肽（Antimicrobial peptides AMPs）是生物细胞特定基因编码，经特定外界条件诱导产生的一类具有多种生物学功能的多肽^[1]。目前，临床上抗弓形虫以化学药物为主，但疗程长，毒副作用大，停药易复发，迫切需要寻找新的抗弓形虫药物^[2]。研究发现，家蝇（Musca domestica）幼虫血淋巴粗提物有杀灭弓形虫的作用^[3]，而家蝇血淋巴中起主要作用的活性物质就是抗菌肽，本实验将在此基础上对有抗弓形虫作用的抗菌肽进行筛选和纯化。

多代培养的纯种品系（山西省疾病预防控制中心）。

大肠埃希菌（军事医学科学院微生物流行病学研究所）；弓形虫RH强毒株（北京大学医学部寄生虫学研究所），本实验室液氮保存，常规保种。

苯甲基磺酰氟（PFSF）（美国Sigma公司）；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)（美国Sigma公司），溶于0.15mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），配制成工作浓度5mg/ml，过滤除菌，4℃避光保存。十二烷基磺酸钠(SDS)（美国Amersco公司），10g SDS溶于100ml二蒸水中配成10% SDS，加入1g KCl；生理盐水（高压灭菌）；胎牛血清培养液（DMEM）（美国Gibco公司）。

AKTA^TM purifier、Resource S（1ml）阳离子层析柱和Superdex G75 HR10/30凝胶分子筛层析柱（瑞典Amersham Pharmacia公司）；ZS-2板式酶标仪(北京新风机械厂)，生物显微镜BH-2型(日本Olympus公司)，血细胞计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司)，96孔培养板(美国Gibco公司)。

将3龄家蝇幼虫间断地放在冰盘上，用蘸有0.15mol/L浓度的大肠埃希菌液的昆虫针刺伤幼虫，然后将其放回新鲜麸皮饲料中饲养24h，诱导抗菌肽的产生。

将幼虫置于研钵中，冰浴下1g幼虫加入0.5ml生理盐水，内含1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，研磨，取匀浆液于4℃，12000 r/min离心30 min，重复2次，除去大分子杂蛋白，取上清液即为血淋巴提取物，-20℃保存备用。将血淋巴提取物进行Resource S柱层析，平衡缓冲液为20mmol/L，pH 6.0的PBS缓冲液，洗脱液为含0.5mol/LNaCl的PBS缓冲液，采用梯度洗脱，流速为0.5ml/min，测定280nm处的紫外吸收值，收集各峰进行抗弓形虫活性检测。将活性部分进行Superdex G75凝胶柱层析，用20 mmol/L，pH 6.0的PBS平衡洗脱，流速为0.35 ml/min，测定280 nm处的紫外吸收值，收集各峰进一步测定抗弓形虫活性。

(1)MTT法检测:参照文献[4]方法将弓形虫速殖子进行分离纯化，用DMEM培养液（含10%胎牛血清）将弓形虫悬液浓度调整为4×10⁷/ml,加入96孔培养板,每孔100μl,分别加入收集的各峰物质，每孔50μl，各做3个复孔,并设不含弓形虫的完全培养基调零孔和含弓形虫的阴性对照孔，各加入50μl PBS，置于4℃冰箱，于24h时加入MTT(5mg/ml) ,每孔10μl，置于37℃，5%CO₂ 饱和湿度条件下孵育4h后，各孔加入10%SDS（含1%KCl）100μl，溶解MTT还原产物，置于温箱15h后用ZS-2板式酶标仪测定450nm 波长吸光度（A）值^[5]。(2)血细胞计数法：参照文献[6]，用DMEM培养液（含10%胎牛血清）将弓形虫悬液浓度调整为10⁶/ml，加入96 孔培养板，每孔100μl，依次加入收集的各峰物质，每孔50μl，各做3个复孔，阴性对照孔加入50μl PBS，置于4℃冰箱，于24h计数速殖子数，按以下公式计算弓形虫存活率。

采用SPSS 11.5软件进行方差分析。

家蝇幼虫的血淋巴粗提物在Resource S柱层析上出现2个峰，分别用R1和R2表示。用MTT法检测，对照组平均A值为0.169，R1组平均A值为0.158，R2组平均A值为0.122，R2组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。血细胞计数法检测显示，对照组弓形虫的存活率为74.25%，R1组弓形虫的存活率为69.3%，R2组弓形虫的存活率仅为34.2%。经血细胞计数法和MTT法检测的结果，发现R2峰物质具有抗弓形虫活性。

图 1

图 1 家蝇幼虫抗菌肽粗提物在Resource S柱上的层析结果

将R2峰物质进行Superdex G75凝胶柱层析，出现6个峰，分别为S1－S6，经MTT法和血细胞计数法检测，活性峰主要集中在S5和S6峰。用MTT法检测，对照组平均A值为0.172，S5组平均A值为0.139，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），S6组平均A值为0.122，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。其余各组与对照组比较差异均无统计学意义。血细胞计数法检测显示，对照组弓形虫存活率为76.50%，S5组弓形虫存活率为49.20%，S6组弓形虫存活率为31.50%，可见S6组抗弓形虫效果较S5组为好。

图 2

图 2 家蝇幼虫抗菌肽粗提物在Superdex G75凝胶柱上的层析结果

表 1

表 1 Superdex G75凝胶柱各峰物质的抗弓形虫活性(x±s)

表 1 Superdex G75凝胶柱各峰物质的抗弓形虫活性(x±s)

目前，抗弓形虫药物以磺胺嘧啶、乙胺嘧啶等化学药物为主，但由于其毒副作用，难以达到彻底治愈效果。因此，有关弓形虫病治疗的研究成为了国内外学者关注的焦点。抗菌肽是一类小分子免疫多肽，具有多种生物学活性，研究者已发现数种具有抗弓形虫作用的抗菌肽^{[6, 7]}。本实验在前一阶段研究的基础上，采用AKTA purifier层析系统，将家蝇幼虫血淋巴粗提物进行了纯化。根据抗菌肽为碱性阳离子小肽，分子量多在20KD以下等特点，设计了阳离子柱和凝胶柱两步层析进行分离纯化。经过Resource S阳离子柱层析后，280nm处出现2个紫外吸收峰，经过MTT法和血细胞计数法检测，发现第2个峰有抗弓形虫活性，2种方法所得结果比较一致。再将活性峰物质用于Superdex G75凝胶柱层析后，280nm处出现6个紫外吸收峰，将其一一进行抗弓形虫活性检测，发现最后2个峰都有抗弓形虫活性，其中S6峰的活性更好一些。由于Superdex G75凝胶层析柱的分离范围为3～70KD，峰的位置与被分离物质的分子量有关，分子量大的会先被洗脱下来，因此，猜测这2种抗菌肽的分子量均应该在20KD以下。但它们究竟属于哪种类别抗菌肽，还有待于对其结构、生理生化性质、氨基酸序列分析等深入研究后证实。随着对抗菌肽研究的不断深入，由于其具有特殊的作用机制和不易产生耐药性等特点，将有可能成为新型的抗弓形虫药物。