中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (10): 1202-1203   PDF    
引用本文
谌志强, 段惠丽, 王新为, 金敏, 王景峰, 陈照立, 李君文, 邱志刚, 晁福寰. 纳米免疫磁颗粒检测大肠埃希菌O157：H7[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(10): 1202-1203.
SHEN Zhi-qiang, DUAN Hui-li, WANG Xin-wei, et al. Preparation of immunomagnetic nanoparticles and application in detection of E.coli O157： H7[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(10): 1202-1203.
纳米免疫磁颗粒检测大肠埃希菌O157：H7
谌志强1, 段惠丽2, 王新为1, 金敏1, 王景峰1, 陈照立1, 李君文1, 邱志刚1, 晁福寰1     
1. 军事医学科学院卫生学环境医学研究所, 天津300050;
2. 军事医学科学院卫生装备研究所
收稿日期: 2008-02-05
基金项目: 国家“863”计划基金项目(2006AA06Z408)
作者简介: 谌志强(1978-) , 男, 江西南昌人, 助理实验师, 硕士在 读, 主要从事食品与环境中病原微生物的检测。
通讯作者: 李君文
摘要： 目的 制备一种表面包被有大肠埃希菌O157:H7多克隆抗体的纳米级葡聚糖免疫磁颗粒,在检测大肠埃希菌O157:H7的同时,对磁颗粒的应用条件进行优化. 方法 FeCl3和FeCl2在氨水条件下与葡聚糖反应生成纳米葡聚糖磁颗粒,利用高碘酸钠将其氧化后,在表面包被上大肠埃希菌O157:H7多克隆抗体,制成纳米免疫磁颗粒进行检测. 结果 该方法可在15 min内完成对样品的分离,检测限为101CFU/ml甚至更少,当样品中含有108CFU/ml的杂菌时,检测限为101~102CFU/ml,杂菌对检测结果影响甚微. 结论 利用纳米级葡聚糖免疫磁颗粒分离目的菌是一种灵敏度高、特异性强、操作简便的有效方法.
关键词： 纳米免疫磁颗粒     葡聚糖     大肠埃希菌O157：H7    
Preparation of immunomagnetic nanoparticles and application in detection of E.coli O157： H7
SHEN Zhi-qiang, DUAN Hui-li, WANG Xin-wei, et al     
Institute of Hygiene and Environmental Medicine, Academy of Military Medical Sciences Tianjin 300050, China
Abstract: Objective To prepare a kind of mag neticiron-dextran nanoparticles that was coated with anti.coli O157:H7 IgG,and to establish the optimum conditions of magnet ic nanoparticles applicatio n for the detection of E.coli O157:H7. Methods Magneticiron-dextran nano particles were prepared by reacting a mixture of ferric and ferrousions with dextran polymers under alkaline conditions.The particles were coated with antiserum against E.coli O157:H7 by the periodat eoxidation-borohydr ide reduction procedure.F inally,the immunomagnetic nanoparticles were prepared for the detection. Results E.coli O157:H7 could be isolated from samples within 15 min with the sensitivity of 101CF U/ml oreven less.In the presence of 108CFU/ml other organisms,the sensitivity was 101-102 CF U/ml.Nonspecfic bacter ium sho wed very weak influence on detection results. Conclusion Isolation of target bacteria by immunomagnetic nanoparticles is an efficient method with high sensitivity and specificity.
Key words: immunomagnetic iron-dextran nanoparticles     dex tran     E.coli O157： H7     isolation    

纳米材料是20世纪90年代后迅猛发展起来的新材料。纳米磁材料(粒径10nm～100nm)具有比表面积大，超顺磁性，磁相互作用很弱，悬浮稳定，在检测中具有极高的敏感性。当颗粒表面用具有功能基团的聚合物包被并与特异性抗体连接后，具有捕获目的微生物的功能，且被分离物的生物学性状和功能不受影响。在微生物的实际分离应用中，免疫磁性纳米颗粒具有快速、高效、特异性分离目的微生物的特点，与快速检测技术相结合，可以实现致病微生物的快速检测与诊断。本文研究了纳米免疫磁颗粒的制备及初步应用于大肠埃希菌O157:H7的分离检测。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂和仪器

葡聚糖T-40、Sephacryl-300(聚丙烯酰胺葡聚糖S-300)凝胶(美国Sigma公司)；FeCl3·6H2O，分析纯(天津市苏庄化学试剂厂)；FeCl2·4H2O，分析纯(天津市文达希贵试剂化工厂)；氨水，分析纯(天津化学试剂三厂)。KQ2200B型超声波清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司)；WH8401-50A型电动搅拌器(天津市威华实验仪器厂)；电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；超强磁(北京钢铁研究所)。实验中所用水都为通过0.22μm滤膜过滤的双蒸水。

1.1.2 抗血清和菌种

大肠埃希菌O157:H7多克隆抗血清(本实验室制备和纯化)；大肠埃希菌O157:H7(882364)(中国预防医学科学院流行病与微生物研究所)。大肠埃希菌19株，金黄色葡萄球菌6株，沙门菌26株，志贺菌24株、小肠结肠炎耶氏杆菌3株，粪链球菌2株(均为本室保存)。

1.2 方法 1.2.1 葡聚糖纳米磁颗粒的制备与纯化

葡聚糖纳米磁颗粒是利用氯化铁、氯化亚铁和葡聚糖在碱性条件下参照文献生成[1-5]。制备好的磁颗粒参照文献[6-8]，用S-300凝胶对颗粒进行纯化，最后将纯化好的磁颗粒定容至8mg/ml，于4℃保存备用。

1.2.2 葡聚糖纳米磁颗粒的氧化

配制25mmol/L NaIO4溶液，在小三角瓶中加入1ml前述纯化好的磁颗粒，往其中加入0.25ml NaIO4溶液。放在摇床(150r/min)上氧化一段时间，再往小三角瓶中加入0.21ml浓度为2mol/L的乙二醇溶液，继续放入摇床0.5h终止氧化。将氧化好的磁颗粒用0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液透析24h，装入洁净EP管中，于4℃保存。

1.2.3 葡聚糖纳米磁颗粒抗体的连接

取0.3ml浓度为0.5mg/ml纯化好的大肠埃希菌O157:H7多克隆抗体加入到1ml纯化好的磁颗粒中，混匀后，放入冰箱过夜(避光)，次日，每ml颗粒加0.2ml的0.5mg/ml甘氨酸溶液，过夜，即成为连有大肠埃希菌O157:H7多克隆抗体的免疫磁颗粒，于4℃保存备用。

1.2.4 大肠埃希菌O157:H7的检测

制备大肠埃希菌O157:H7菌悬液，用平板倾注法进行计数，取102CFU/ml梯度的菌悬液作为备检样品。在1.5ml灭菌EP管中加入1ml备检样品，再加入一定量的免疫磁颗粒，混匀，置于摇床(20r/min)上室温孵育一段时间；超强磁吸引数3～5min，吸去液体；移去超强磁，加入洗液(0.01mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，加入0.05%的Tween-20约1ml，振荡，超强磁吸引3～5min，吸去液体；再加入50μl洗液，轻弹管壁，使颗粒都在液体中，用移液器将管中液体移至远藤平板上，于37℃下培养24h后进行计数。将此次的计数结果与菌悬液的最初计数结果进行比较，即得出了免疫磁颗粒对大肠埃希菌O157:H7的回收率。

2 结果 2.1 葡聚糖纳米磁颗粒的性状

制备的葡聚糖纳米磁颗粒大小比较均一，呈圆形。在扫描电镜下颗粒直径为40～60nm，在透射电镜下可以看到其核心为约为5nm。颗粒性质稳定，通过实验可知，在4℃下保存1年性能没有改变，pH值耐受范围为4～10。具有很好的磁响应性。免疫磁颗粒在捕获大肠埃希菌O157:H7的扫描电镜照片，可见其表面有大量磁颗粒吸附。

2.2 葡聚糖纳米磁颗粒氧化时间

磁颗粒的氧化在本方法中是一个至关重要的步骤，它的结果直接影响到磁颗粒能否连上抗体以及连接抗体的多少。通过实验，得出最佳氧化时间(表 1)。

表 1 氧化时间对回收率的影响(x±s,n=5)

从表 1可见，氧化时间为6h时，免疫磁颗粒对菌的回收率最高，达到91.4%。为此，将6h定为最佳氧化时间。

2.3 检测时孵育时间的确定

孵育是检测过程中最为费时的一步，为达到快速检测的目的，应在保证一定回收率的情况下尽量缩短孵育时间，所以孵育时间定为10min。

2.4 免疫磁颗粒的特异性(表 2)

用大肠埃希菌O157:H7免疫磁颗粒检测其他的细菌，方法同检测大肠埃希菌O157:H7，只是培养基改为适合被检测菌生长的培养基。共检测80株不同细菌，假阳性率为2.5%。免疫磁颗粒出现假阳性的主要是多克隆抗体产生了交叉反应的原因。

表 2 大肠埃希菌O157:H7免疫磁颗粒的特异性

2.5 免疫磁颗粒的灵敏度

将大肠埃希菌O157:H7的菌悬液稀释至5,10,20,50,100CFU/ml，应用前面的检测方法，测定免疫磁颗粒的灵敏度结果表明，1ml样本中即使只有10个细菌也能被很好的回收(可回收4～8个)。

3 讨论

免疫磁性分离技术是在20世纪90年发展起来的一项新技术。但是，目前用免疫磁性分离技术分离环境微生物，需用的磁性微球和相应的磁性分离器，价格相当昂贵，不利于该技术在国内的普及。本研究研制的免疫磁颗粒制备方法简单，性质稳定，成本低廉，在应用过程中用量少，操作简便，不需特殊仪器，分离效果理想，在实验室和现场均能操作。

传统的大肠埃希菌O157:H7检测方法，不仅费时费力、成本较高，而且由于抑制物或背景菌的存在，使后续的检测阳性率不高。特别是当目的菌含量特别低的时候，假阴性率将会更高。用大肠埃希菌O157:H7免疫磁颗粒进行分离检测，将大大提高检测灵敏度与特异性，对于1ml水样本，在15min内就可分离出目标菌，10个/ml以下的菌体都可被检出。

免疫磁颗粒的制备有2个关键点，1是磁颗粒的制备，2是抗体的质量要好。同大肠埃希菌O157:H7免疫磁颗粒一样，只要有不同的抗体，就能做出检测不同微生物的免疫磁颗粒，这将为以后各种微生物的分离检测提供更加便捷的途径。

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