早幼粒细胞白血病基因(PML)和维甲酸受体(RARα)融合形成PML-RARα或RARα-PML融合基因，在急性早幼粒细胞性白血病(APL)的发生发展中起重要作用。有研究表明^[1]，PML-RARα在早期骨髓细胞的活性依赖于中性白细胞弹性蛋白酶(Neutrophil Elastase，NE)，NE可将此蛋白切割成53KD和69KD大小的2种蛋白，进而影响其功能。本实验利用特异性引物扩增PML-RARα融合基因中含RARα基因序列的一段，因其包含了PML的核定位信号区域(NLS)，不同于单纯的RARα，命名为RARα变异蛋白(RARα variant protein，RARα-V)，构建酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-RARα-V，使其在酵母细胞中表达，为利用酵母双杂交系统进一步寻找与其相互作用的蛋白，以探讨其作用机制。

PML-RARα融合蛋白质粒pcDNA3.1-PML-RARα(美国华盛顿大学Andrew A Lane教授惠赠)；大肠埃希菌DH5α菌株(本室冻存)；质粒小抽试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒(上海华舜公司)；限制性内切酶EcoRI，SalI、T4连接酶、高保真酶Primerstar、PCR试剂及DNA分子量标准(日本TaKaRa公司)；胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖(美国Oxide公司)；pGBKT7-BD克隆载体、酵母转化试剂盒、DNA结合域(BD)单克隆抗体、酵母菌株AH109、营养缺陷(SD)基础培养基、完全极限培养基、X-α-gal等(美国Clontech公司)；硫酸腺嘌呤、三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸二钠(TE)、醋酸锂(LiAC)、玻璃珠、蛋白酶抑制剂胃酶抑素A(Pepstatin A)、亮肽素(Leupeptin)、苯甲脒(Benzamidine)、抑肽酶(Aprotinin)及苯甲磺酰氟(PMSF)(美国Sigma公司)；辣根过氧化物酶标记-羊抗鼠多克隆抗体(美国Santa公司)；化学发光试剂盒(中国Viagene公司)；预染蛋白Marker(北京赛百胜公司)；所需引物由上海生工生物技术公司合成。

在pcDNA3.1-PML-RARα质粒中，将其下游RARα-V序列作为目的基因设计引物：上游引物：5'-CAGGAATTCGCTGTGGTACAGTCAGTG-3'；下游引物：5'-AGGGTCGACTCCATGTGGCGTGGG-3'；分别在上游引物5'端，下游引物5'端引入限制性内切酶EcoR I和Sal I酶切位点，预期扩增产物长度为1584bp。PCR反应体系及参数为：5倍缓冲液4μl、dNTP 2.5μm、上下游引物各10 pmol、高保真酶Primerstar 0.6U、DNA模板100 ng、ddH₂O补至20 μl；预变性98℃5 min；98℃15 s，58℃40 s，72℃ 2 min，35个循环；72℃10 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳后胶回收试剂盒回收目的条带，并测定浓度。

用EcoR I和Sal I酶对PCR产物双酶切4 h，酶切体系：PCR产物1μg，EcoR I酶1 μl，Sal I酶1 μl，H缓冲液1 μl，双蒸水补至20 μl。1%琼脂糖凝胶电泳进行胶回收，该片段与同样双酶切回收后的pGBKT-7载体测浓度后按1：5的比例于16℃过夜连接，转化至大肠埃希菌(DH5α)感受态细胞。铺含30μg／ml卡那霉素的质脂双层(LB)平板培养，37℃24 h后挑取单克隆进行摇菌，提质粒进行酶切鉴定，阳性克隆测序鉴定。

TE／LiAC方法制备酵母AH 109感受态细胞，用PEG／LiAC法将pGBKT7-RARα-V转化到酵母感受态细胞AH109。将转化有pGBKT7-RARα-V的感受态细胞铺色氨酸缺陷平板(SD/-Trp)，30℃培养3～5 d，挑取直径2～3mm的菌落进行菌落PCR、质粒提取以验证载体pGBKT7-RARα-V是否己转化进AH109细胞。

分别挑取转化了空质粒pGBKT7和转化了诱饵质粒pGBKT7-RARα-V的大个单克隆，放入装有5 ml的SD/-Trp液体培养基混匀后于30℃震摇培养15 h；次日取2 ml过夜菌移至20 ml相同培养基中继续振摇培养3 h，测的吸光度(A₆₀₀)值，以了解诱饵蛋白是否有毒性作用。将转化有质粒pGBKT7-RARα-V的菌液分别铺在SD/-Trp/X-α-gal，SD/-His/-Trp/X-α-gal，SD/-Ade/-Trp/X-α-gal，SD/-Trp/-Leu培养基平板上，30℃培养3～5 d后观察平板的生长情况，来检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用。

参照文献^[1]提取诱饵蛋白。然后进行十二烷基碳酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)，100 V转膜1.5 h，5%脱脂奶粉封闭过夜，一抗(抗BD单克隆抗体)37℃ 2 h，二抗(羊抗鼠)37℃ 1 h，化学发光法检测目的条带。

成功扩增出RARα-V片段。电泳可见1584 bp左右的扩增条带，与预计大小吻合。

图 1

注：1，2：RARα-V片段PCR产物；M：DNA分子标准。 图 1 RARα-V基因片段PCR电泳结果

经EcoRI和salI双酶切得到1578bp与7.3kb 2个预期大小的片段。测序结果显示，扩增的基因片段与预期完全相符。

图 2

注：M：DNA分子标准；1：pGBKT7空载体；2：pGBKT7-RARα-V的酶切分析。 图 2 诱饵质粒pGBKT7-RARα-V的双酶切分析图谱

将SD/-Trp平板上生长的阳性克隆作为PCR模板，进行PCR扩增，扩增出1584 bp的目的基因片段。菌落PCR结果表明与目的片段大小一致，诱饵质粒pGBKT7-RARα-V已成功转化到酵母AH109细胞中。

图 3

注：M：DNA分子标准；1，2：PCR产物。 图 3 pGBKT7-RARα-V重组质粒转入细胞的菌落PCR鉴定

A600值：转入空载体AH109的A600=0.836，转入诱饵质粒的AH109的A600=0.824，根据Clontech的操作说明书，A值>0.8认为诱饵质粒无毒性作用。仅在SD/-Trp/X-α-gal平板上生长白色克隆，在SD/-Trp/-His/X-α-gal平板上无克隆生长，认为诱饵质粒pGBKT7-RARα-V无渗漏。同时SD/-Trp/X-α-gal平板中未出现蓝色克隆，在SD/-Ade/-Trp/X-α-gal平板上无克隆生长，说明诱饵质粒pGBKT7-RARα-V无自激活作用。

分析可见，条带大小在80KD左右，与预期结果相一致，说明诱饵质粒在AH109酵母细胞中能稳定表达。

图 4

图 4 诱饵蛋白的WesternBlotting分析

PML-RARα在急性早幼粒细胞白血病的发病中起着关键性的作用。Lane等发现^[2]，在急性单核细胞白血病细胞系来源的U937纽胞中，它被细胞中的中性白细胞弹性蛋白酶(Neutrophil Elastase，NE)切割成53和69KD大小的2种蛋白质。NE与bcr-1型PML-RARα在早期骨髓细胞中的许多活性有关^{[3, 4]}。PML-RARα在U937细胞中作为NE的作用底物，被裂解成2段约为53和69KD大小的蛋白，而裂解产物的作用机制不明^[5]。

本实验构建诱饵表达载体pGBKT7-RARα-V，并且已经成功转化进入AHl09酵母细胞中。挑取在SD/-Trp平板上单个菌落接种于SD/-Trp液体培养基中，次日测定A600为0.824，表明诱饵质粒对酵母AH109细胞无毒性。再将转化了诱饵质粒的菌落分别接种于SD/-Trp/X-α-gal的平板上，发现有菌落生长，但是并无蓝色的菌落出现，而且在SD/-Trp/-Leu平板上也无生长。同时在SD/-Ade/-Trp/X-α-gal平板上无克隆生长说明诱饵蛋白并没有自激活作用。SD/-Trp/-His/X-α-gal，SD/-Trp/-Ade/X-α-gal平板上均无菌落生长，证明它无渗漏现象，诱饵蛋白与BD结构域一起融合表达，预期融合蛋白大小约为80 KD，经Western Blotting验证，在80 KD处检测到明显的蛋白条带，表明RARα-V已成功表达。以上的判断标准和已有文献一致^[6]。

实验表明，RARα-V诱饵载体成功构建并在AH109酵母细胞中成功表达，为进一步运用酵母双杂交系统在活细胞内筛选与其相互作用的靶蛋白提供了实验基础，有助于从分子水平深入探讨急性早幼粒白血病的发病机制。