流行性感冒(简称流感)，是由甲(A)、乙(B)、丙(C) 三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病。甲、乙、丙不仅反映了病毒被发现的年代及前后顺序，更主要的是反映对人类危害程度的顺序。目前，国际上预防与治疗流感的主要措施有疫苗接种、药物治疗和预防。在有效流感疫苗研究滞后的情况下，抗病毒药物既能用于预防流感，又能为急症患者提供治疗，因此，在控制流感方面发挥着重要作用。现在使用的抗流感病毒药物主要有2种：M₂离子通道阻滞剂和神经氨酸酶抑制剂(NIs)，了解流感病毒耐药发生机制、耐药现状对指导药物合理使用以及防控流感大流行具有重要意义。

1 流感的防治 1.1 疫苗接种

疫苗是预防流感最便捷有效的方法。目前国际上广泛使用的是纯化的针对A、B、C流感病毒多价灭活疫苗。正在研究的还有基因工程疫苗。病毒亚单位裂解是疫苗研制和生产的前提^[1]。每种疫苗均含有甲1、甲3和乙型3种流感灭活病毒或抗原组份，对可能出现的甲1、甲3和乙型流感均有预防作用。我国使用的流感疫苗有3种：全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。由于接种疫苗后人体产生的抗体水平会随着时间延续而下降，并且每年疫苗株成分因流行优势株不同而有所变化，所以每年都需要接种当年度的流感疫苗，疫苗的有效性必须与流行株相匹配^[2]。一旦新流行株出现，新疫苗的生产至少需要4~6个月时间，此外疫苗预防效果还与接种者年龄、免疫状态有关。因此，疫苗的作用有一定局限性。

1.2 药物治疗和预防

目前有2类药物：M₂离子通道阻滞剂如金刚烷胺、金刚乙胺；NIs如扎那米韦和奥司他韦(商品名达菲Tamiflu) 已经批准用于治疗人类甲型流感。其中金刚烷胺、金刚乙胺和达菲已经批准用于预防人类甲型流感。有些国家，上述4种化学药物均是处方药，为提高治疗效果，这些药物必须经临床确诊后尽快开始使用^{[3, 4]}，以减少流感症状并缩短病程，也能减弱流感的传染性。但对普通感冒和其他病毒引起的类似流感样疾病没有效果。

2 M₂离子通道阻滞剂(金刚烷胺)

金刚烷胺是最早用于抑制流感病毒的药物，金刚乙胺1987年上市1993年获美国食品药品署(FDA) 批准在美国上市，2001年由中国食品药品监督管理局(SFDA) 批准在我国上市，商品名：立安，已使用多年。

2.1 M₂离子通道阻滞剂抗病毒分子机制

由流感病毒基因组第7节段编码的M蛋白是除血凝素(HA) 神经氨酸酶(NA) 外第3种跨膜蛋白，含97个氨基酸，具有高度保守性。包括MI和M₂两部分。M₂蛋白第25~43个氨基酸为膜贯通区，中心为筒状通道，通过该通道氢离子出入，对病毒感染具有重要作用。M₂离子通道阻滞剂抗病毒机制有2个^[5]：(1) 金刚烷胺与M₂蛋白离子通道中“鸟笼”状结构结合，阻断离子通道，抑制离子内流。核糖蛋白(RNP) 因不能游离而以RNP-M1复合体形式滞留在细胞质中，从而抑制病毒复制。(2) 对禽流感病毒株，抑制病毒复制的晚期，当血凝素转运至细胞膜，与低ph下间接改变血凝素结构有关系。B型流感病毒也有相当于A型流感病毒M₂蛋白的NB蛋白，充当离子通道。因NB结构与M₂不同，故金刚烷对其无效。此外，C型流感病毒亦存在着CM₂通道蛋白，其耐药性的获得源于CM₂蛋白中1个氨基酸的置换。

2.2 M₂离子通道阻滞剂耐药分子机制

由于M₂跨膜域A螺旋区的部分氨基酸突变，主要发生在27，30，31和34位氨基酸，以第31位最为多见。这些氨基酸与M₂蛋白构筑的离子通道并存，形成金刚烷胺结合部位。由于氨基酸置换，金刚烷胺不能与离子通道结合，无法抑制离子内流而发生感染。不同病毒亚型突变位点与频率不同：H3N2亚型常在31位发生突变(丝氨酸-天冬氨酸)^[6]，而H1N1亚型则在27位发生突变(缬氨酸-丙氨酸)，前者突变频率高于后者。突变的病毒保持良好的遗传特性，可以在人与人之间进行传播^{[7, 8]}。最近，Astrahan^[9]等发现，流感病毒可以通过增大离子通道口径，使药物虽然能够与M₂结合却不能完全封闭离子转运，从而产生耐药性。

2.3 病毒对M₂离子通道阻滞剂耐药现状

金刚烷的使用已有近30年历史，对甲型流感病毒株的耐药监测始于1991年，1994~1995年，H3N2病毒对金刚烷胺和金刚乙胺耐药率为0.4%，2003~2004年增至12.3%。国内研究也证实，流感病毒对金刚烷类药物耐药增加明显^{[10, 11]}。H3N2病毒1989~1999年没有发现耐药，2002年耐药比例3.4%，2003年升到56.0%，2005年达77.6%。金刚烷类药物在美国作为抗流感药被批准，医师只给流感或流感样疾病病人开这类药的处方。但在中国、俄罗斯和其他一些国家，由于SARS突发后，非处方药金刚烷胺使用率增加，很多感冒药中亦含金刚烷胺和金刚乙胺，使得病毒耐药性的产生机率飞速增长。其次，流感耐金刚烷胺株在服用48h即可产生，耐药株传播速度较快。此外还存在神经毒性，对B、C型流感无效，因此，在临床上的应用受到限制^[12]。耐药株可能是原发耐药，也可能是继发耐药，2者关系有待进一步研究。

3 神经氨酸酶抑制剂

NIs的研究始于1969年，1993年获得扎那米韦；1996年首次合成奥斯他韦(达菲)，2002年获准在中国推出。现在上市的奥斯他韦有2种剂型，一种是胶囊，一种是口服悬浊液。与安慰剂相比，扎那米韦和奥斯他韦可使流感急性症状的持续时间缩短1~2.5d，并发症发生率降低50%~70%，患者提前1~3d恢复正常活动能力^[4]。多数试验显示，发病后越早给药，治疗效果越明显^[3]。卫生部发布的《人禽流感诊疗方案(2005版)》中，达菲被列为抗流感病毒治疗的首选药物，同时达菲也是世界卫生组织推荐作为人禽流感预防和治疗的储备药品。目前还有一种神经胺酸酶抑制剂帕拉米韦(Peramivir)，又名RWJ2270201或BCX-1812，是一个新颖的环戊烷类抗流感病毒药物，正在进行三期临床试验。该制剂在细胞培养中能高选择抑制A、B型流感病毒NA，从而抑制病毒复制。该制剂对A、B型流感病毒的活性比扎那米韦和奥司他韦强^[13]。

3.1 NIs抗病毒机制

流感病毒在宿主细胞内复制表达和组装之后，会以出芽的形式突出宿主细胞，但与宿主细胞以凝血酶-唾液酸相连接，NA催化唾液酸水解，解除成熟病毒颗粒与宿主细胞之间的联系，使之可以自由移动侵袭其他健康的宿主细胞。NIs通过与NA结合，阻断其活性位点，阻止病毒颗粒的释放，切断病毒的扩散链。由于NA的活性位点属于流感病毒的高度保守区，不随病毒的变异而轻易改变，故这类药物可同时抑制A、B型流感病毒，不易引起抗药性且耐受性好，是目前流感治疗药物研究中的突破性进展。

3.2 NIs耐药机制

流感病毒对NA抑制剂的耐药率较低，但近年来，在细胞培养的流感病毒中和临床上皆发现了耐扎那米韦和奥斯他韦的病毒株，目前已确认有2种不同耐药机制^[14]。

3.2.1 酶功能受损导致耐药

流感病毒NA酶活性部位氨基酸残基被其他基团取代。体外试验已经检测到了甲型流感病毒3个耐药毒株，亚型为N1和N2(N1型NA的H274Y，N2型的R292K，N2型的E119V)。Gubareva等^[15]研究发现，NA的119或274位氨基酸残基改变，会出现至少耐一种NA抑制剂的现象，而在NAl52或292位发生改变，则会出现NA抑制剂间交叉耐药的现象。如NA119和292位氨基酸突变，对奥斯他韦敏感性分别下降约20倍和104倍，动物实验的感染性下降100~1000倍。交叉耐药程度的差异是由药物与NA氨基酸残基作用时结构变化不同所引起的。NA的第292位氨基酸被取代，病毒对扎那米韦中度耐药，但对奥斯他韦则高度耐药。帕拉米韦临床应用的耐药发生机率极低，其耐药突变基因存在于NA的58位和211位氨基酸残基，而病毒16HA暂时没有发现耐药基因，不会限制其在临床上的应用^[10]。

3.2.2 NA功能依赖性降低

在不同病毒早期传代中，NA存在的情况下，可观察到病毒对NIs敏感性降低，主要是由于HA受体结合部位或其周围发生突变，使病毒在细胞受体上出芽的能力降低，因其对NA功能的依赖性降低，以致在细胞培养中病毒对NA抑制剂产生广谱交叉耐药。但其机制尚需进一步研究。

3.3 病毒对NIs耐药现状

WHO有关NIs耐药性监测机构建立在1999年药物批准使用。2002年监测结果显示，甲型流感病毒对NIs耐药发生率仅为0.33%，明显比M₂受体阻滞剂发生率低。流感耐药突变株一般出现较晚，大多在用药4d之后。耐药毒株的生物活性实验表明，这些突变株降低了感染病毒的生物活性，临床上该病毒传播能力低、致病性小。细胞培养和临床试验均未发现乙型流感病毒对达菲敏感性下降。

达菲在我国批准上市时间不长，且价格较贵，尚未在人群中大范围推广。但是未来该药的广泛使用也必将会导致高耐药率的发生^[17]。与成年人相比，达菲的抗药性更容易出现在儿童身上^[18]。在日本，大约16%~18%的儿童在服用达菲进行普通流感的治疗过程中产生抗药性^[19]，经分析，可能是大多受试者均为首次感染流感病毒，以前未使用过抗病毒药，机体缺乏一定免疫力，在治疗时需要加大用药剂量。此项假设被另外一项在日本进行的试验证实，该试验使用以体重为基础的用药剂量，研究中未分离出任何耐药毒株。因此提示在缺乏免疫力的此类人群中，可能需要大剂量和/或长时间治疗来降低药毒株出现的可能性。

4 抗流感病毒药物的联合使用

Ilyushina NA^[20]等体外验研究证实，2类抗流感病毒药物联合使用降低甲型流感病毒耐药性发生。试验病毒A/Nanchang/1/99(H1N1)，A/Panama/2007/99(H3N2)，和A/Hong Kong/156/97(H5N1)，联合使用金刚烷胺和低剂量达菲治疗时MDCK细胞的病毒产量显著减少。而只用金刚烷胺治疗，经过5次传代后，病毒M₂蛋白出现V272A，S31N/I变异；只用NIs治疗的细胞出现病毒HA变异。空斑减少实验显示这些NA变异与唾液酸受体结合的效力降低，并且对NIs敏感性降低。重要的是联合使用药物，HA、NA、M₂蛋白都没有出现变异。因此，体外联合化疗可以减少流感病毒耐药性的发生。这种策略将作为控制流感病毒感染的方法，并且将与其他新药进行摸索。

5 展望

在流感治疗方面，NA抑制剂扎那米韦、奥斯他韦与M₂抑制剂金刚烷胺、金刚乙胺相比具有许多优点，它们抗病毒谱广，耐药性少，耐受性好，且明显降低因流感引起的呼吸道症状而应用抗生素的机会。GraemeL^[21]等指出，当一种新的流感病毒出现，针对该病毒的疫苗尚未生产出来，可以将NIs作为抗新流感病毒的第一线药物。2005年流感季节，美国大约有170万个处方使用了奥斯他韦，但这并不意味着应该完全放弃M₂蛋白抑制剂。尽管2003年从中国、泰国、越南、柬埔寨分离的H5N1病毒都有相同的耐药性位点(Ser31Asn)，但来自印度尼西亚、蒙古、俄罗斯、土耳其的病毒对金刚烷胺敏感，而且下一次流行的流感病毒很可能是类似于对M₂抑制剂敏感的H2N2。因此，M₂抑制剂会为流感的预防提供一个廉价选择。

体外及动物模型研究表明，M₂抑制剂和NIs联合使用将会增强抗病毒疗效。对于流感病毒这类变异性极强的病毒，治疗和预防用药应谨慎。为了避免耐药性的发生以及有效预防新型流感的大流行，应建立耐药监测机制，并且尽快研究合理使用2类药物的有效方法。