近年来,随着环境污染的加剧,造成大量有害菌的孳生^[1-4]｡目前的消毒杀菌方法和消毒剂往往存在作用时间长､选择性强､药剂使用量大､有残留､容易造成二次污染等缺点｡大连海事大学环境研究所采用大气压强电场电离放电技术制备羟基自由基溶液^[5-8],既满足快速无选择消除微生物污染的需要,又遵循绿色化学12条原则^{[9, 10]},确保了公共卫生安全｡本项研究以酵母菌为供试菌体模拟引起环境污染的有害微生物,采用喷洒形式分别就羟基自由基的浓度､喷洒密度和作用时间与灭菌效果之间的关系进行实验,验证羟基自由基溶液在杀菌消毒方面的作用｡

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试菌种

酵母菌(Torula)(武汉病毒所实验室)｡

1.1.2 羟基自由基溶液雾滴的制备

采用大气压强电场电离放电,使大部分电子的平均能量接近或大于13eV,而使O₂和H₂O蒸汽激发､超激发､分解和电离成为OH^[5]｡把制取的·OH再以>98%的高传质效率解于水中,制成羟基溶液｡采用1035BP型电动机喷洒成粒径为250 μm的·OH雾滴,再经离子源使雾滴荷电,在外加电场作用下定向喷洒到染菌载片上进行杀毒灭菌实验｡

1.2 实验方法

选取酵母菌为供试菌种模拟引起生物污染的微生物｡配制浓度为107cfu/ml的菌悬液,取10μl菌液加到无菌不锈钢载片(12 mm×12 mm)上,涂布均匀,在超净工作台上自然干燥90 min｡将3块染菌载片对称放入无菌玻璃平皿中,再以实验选定浓度的羟基溶液雾滴喷向染菌载片,进行消毒杀菌实验｡每次喷雾在载片上的·OH溶液密度要一致,在载片上的密度以不使载片湿透､流液为度｡待喷洒完毕后,立即取每种载体菌片1片,各放入5.0 ml的无菌中和剂(含5 g/L硫代硫酸钠和0.1%蛋白胨的混合溶液)中,用电动混合器混合20s后再进行活菌计数｡

1.3 检测方法

采用自制的电化学法·OH溶液浓度测试仪检测溶液中的·OH浓度,·OH溶液比值浓度是指以·OH为主的水溶液体系中的总氧化力按羟基的氧化力折算得出对应的羟基溶液比值浓度,并用苯甲酸荧光法进行校核｡采用平板涂布计数法和平板菌落计数法进行活菌计数｡

2 结果 2.1 ·OH溶液比值浓度对灭菌效果的影响

按照试验方法,设定·OH雾滴在染菌片上的喷洒浓度为21 ml/cm²,取不同的浓度梯度进行杀菌试验｡载片上最初涂抹的酵母菌菌液约为105个,当·OH溶液浓度为0.12 mg/L时,存活的酵母菌落数约为104个,致死率达到90%;当OH溶液浓度为0.23 mg/L时,存活的酵母菌落数约为103个,致死率达到99%;当·OH溶液浓度为0.56 mg/L时,存活的酵母菌落数约为几个;当·OH溶液浓度为0.6 mg/L时,酵母菌被完全致死｡可见菌落数随·OH溶液浓度的增加而降低,且阈值浓度为0.6 mg/L｡

2.2 喷洒密度对灭菌效果的影响

按照试验方法取·OH溶液浓度为0.6 mg/L时,对酵母菌进行喷洒密度对杀菌效果的影响实验｡当喷洒密度为3.5μl/cm²时,活菌数由105个降至5×103个;当喷洒密度为7μl/cm²时,活菌数降至6×102个;继续增加喷洒密度,当达到14 μl/cm²时,活菌数降至25个:当·OH溶液雾滴喷洒密度达到21 μl/cm²时,酵母菌完全杀灭｡此时载片湿润,但尚未达到湿透或流淌｡

2.3 作用时间对杀菌效果的影响

按照试验方法取·OH溶液浓度为0.6 mg/L､喷洒雾滴密度为21 μl/cm²,进行作用时间与灭菌效果的影响实验｡当·OH浓度和喷洒密度达到设定值时,致死酵母菌的生化反应在1 s内完成｡但由于1 s内的反应时间很难检测,所以认为是1 s｡

3 讨论

·OH有强氧化性,其雾滴可使微生物体内大分子的核酸､蛋白质和DNA等发生过氧化反应,并导致细胞不可逆的直接损伤而死亡｡在低浓度和低密度下,·OH对酵母菌已有很大的杀伤作用,即使对含有子囊孢子的酵母菌所用的·OH浓度和密度较其他灭菌剂还是很低｡实际应用中适当扩大·OH溶液浓度(0.8 mg/L)和喷洒密度(24 μl/cm²),可更有效的消除微生物污染问题｡本实验表明:(1)由于·OH的氧化电位高达2.8 V,实现了低药剂量无选择致死微生物｡(2)·OH参与生化反应是属于自由基反应,反应速率常数大多在109 L/(mol·s)以上,甚至超过扩散系数极限值[10¹⁰ L/(mol·s)],致死微生物的生化反应时间仅为1 s,满足了快速消除微生物污染的要求｡(3)致死微生物的·OH溶液喷洒密度低,仅为21μl/m²｡(4)·OH雾滴最终将细菌氧化成CO₂､H₂O和微量无机盐;剩余的·OH也将分解成H₂O和O₂,实现了零环境污染的绿色消除微生物污染的目的｡