中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (9): 1103-1104   PDF    
引用本文
魏丽, 彭瑞云, 高亚兵, 王水明, 马俊杰, 李杨, 徐新萍, 邱萍, 杨国山. 微波辐射对大鼠海马神经元损伤作用[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(9): 1103-1104.
WEI Li, PENG Rui-yun, GAO Ya-bing, et al. Injuries of hippocampus neurons of rats after microwave radiation[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(9): 1103-1104.
微波辐射对大鼠海马神经元损伤作用
魏丽1,2, 彭瑞云1, 高亚兵1, 王水明1, 马俊杰1, 李杨1, 徐新萍1, 邱萍1, 杨国山1     
1. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京100850;;
2. 首都医科大学附属北京同仁医院
收稿日期: 2007-12-20
基金项目: 全军“十一五”专项科研基金(06Z065)
摘要： 目的 观察高功率微波(HPM)辐射后原代培养大鼠海马神经元中钙-钙调蛋白依赖蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)的变化及其意义。 方法 采用30 mW/cm2HPM辐射原代培养大鼠海马神经元,于辐射后1 h,采用免疫细胞化学等方法观察海马神经元中磷酸化-CaMKⅡ(p-CaMKⅡ)的变化。 结果 30 mW/cm2HMP辐射后1 h,大鼠海马神经元细胞形态有所改变,部分细胞胞体略萎缩,胞浆减少,突起变细,长度变短;免疫细胞化学结果显示,同假辐射组比较,辐射组大鼠海马神经元胞浆中棕黄色颗粒明显增多,颜色加深;免疫荧光结果显示,同假辐射组比较,辐射组大鼠海马神经元胞浆中红色荧光明显增强。p-CaMKⅡ表达明显增加。 结论 HPM辐射后大鼠海马原代培养神经元中CaMKⅡ磷酸化增强,参与了海马神经元损伤及突触可塑性改变的病理生理过程。
关键词： 高功率微波     海马     钙-钙调蛋白依赖蛋白激酶    
Injuries of hippocampus neurons of rats after microwave radiation
WEI Li, PENG Rui-yun, GAO Ya-bing, et al     
Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China
Abstract: Objective To investig ate the changes and significance of the expression of CaMK Ⅱ in pr imary cultured hippocampus neurons after high power microwave(HPM)radiation. Methods HPM device was used to radiate primary cultured hippocampus neurons,which were observed 1 h after the radiation.The changes of the expression of p-CaMK Ⅱ in primary cultured hippocampus neurons were analysed by immunohistochemistry and other methods. Results The morphological changes of the neurons were observed within 1 h after 30 mW/cm2 radiation.Some neurons were atrophied,the cytoplasm was decreased,the dendrites were shorter and thinner.The levels of p-CaMK Ⅱ in the neur ons were weak at 1 h after 0 mW/cm2 radiation and strong at 1 h after the radiation by immunohistochemistry.The levels p-CaMK Ⅱ were increased 1 h after radiation.The levels of p-CaMK Ⅱ in primary culturd hippocampus neurons were also increased 1 h after radiat ion by immunofluorescence and laser scanning confocal microscopy. Conclusion HPM radiation may increase the phosphorylation of CaMK Ⅱ in primary cultured hippocamous neurons,which is contributed to the pathophysiological process of the injuries of hippocampus tissue.
Key words: high power microwave     hippocampus     CaMK Ⅱ    

微波辐射可引起学习记忆改变[1, 2]｡突触可塑性是学习记忆的神经基础｡N 甲基 D 天冬氨酸受体(N Methyl D Asparate receptor,NMDAR)与长时程增强(long term potentiation,LTP)､学习记忆关系密切;Ca2+通过NMDA型谷氨酸受体内流导致钙 钙调蛋白依赖蛋白激酶(Ca2+/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ,CaMK Ⅱ)激活和突触后聚集,导致LTP;学习记忆形成及突触可塑性与CaMK Ⅱ的活性改变密切相关[3-6]｡为此,本文对高功率微波(high power microwave,HPM)辐射后海马神经元CaMK Ⅱ的变化进行研究,探讨HPM辐射后海马神经元损伤及突触可塑性改变的病理生理过程｡

1 材料与方法 1.1 主要试剂

胰蛋白酶(美国Amresco公司);多聚赖氨酸(美国Sigma公司);谷氨酰胺(美国Hyclone公司);羟乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid,HEPES)(美国Amersham公司);胎牛血清(DMEM)培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)和阿糖胞苷(美国Sigma公司);胎牛血清和马血清(美国Invitrogen公司),鼠抗p CaMK Ⅱ(英国Abcom公司);羊抗鼠免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)和罗丹明(北京中杉金桥技术有限公司);生物素标记的羊抗鼠IgG(北京中山生物技术有限公司);其他相关试剂均为国产｡

1.2 细胞培养方法

取出生12h以内的Wistar雄性大鼠10只,冰冻麻醉后,用75%乙醇浸泡消毒5min｡无菌条件下在盛有磷酸盐缓冲液(PBS)的平皿内断头取脑,按文献[7]方法培养细胞备用｡

1.3 细胞鉴定

采用免疫细胞化学技术(SP法)对神经元的标志物神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和胶质细胞的标志物神经胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)进行检测,按文献[8]方法｡结果判定:阳性结果为棕黄色,位于细胞浆内,苏木素复染胞核呈淡蓝色｡

1.4 分组

培养的细胞经HPM辐射,分为假辐射组和辐射组,平均功率密度分别为0和30mW/cm2,辐射时间为5min｡

1.5 免疫细胞化学检测神经元p CaMK Ⅱ

于HPM辐射后1h捞片,甲醇和丙酮按1∶1混合液固定,4℃保存备用｡主要步骤同细胞鉴定,其中特异性抗体为鼠抗p CaMK Ⅱ,1∶100(PBS)稀释,二抗为生物素化羊抗鼠(Bio IgG)工作液｡对照实验:用PBS代替一抗作阴性对照,其余步骤同上｡结果判定:阳性结果为棕黄色,位于细胞浆内,苏木素复染胞核呈淡蓝色｡1.6免疫荧光技术检测神经元p CaMK Ⅱ细胞爬片的制备如前述;于HPM辐射后1h捞片,甲醇和丙酮按1∶1混合液固定｡室温孵育30min;缓冲液漂洗3次;加鼠抗p CaMK Ⅱ 1∶100(PBS)稀释,37℃ 40min;4℃过夜;PBS洗3×3min;加罗丹明,1∶100(PBS)稀释,室温孵育2h;PBS洗3×3min;加0.5ml PBS;应用激光扫描共聚焦显微镜进行检测｡对照实验:用PBS代替一抗作阴性对照,其余步骤同上｡结果判定:阳性结果为红色荧光,位于细胞浆内,胞核仅有少量微弱荧光｡

2 结果 2.1 大鼠海马原代培养细胞鉴定结果

原代培养的海马神经元于12h后贴壁生长,第4d时,细胞伸出细丝状神经突起｡生长至7~10d时,细胞状态最好,呈圆形､三角形,胞体饱满,立体感强,突起丰富,交织成网状｡生长至20d时,细胞逐渐萎缩,坏死,脱落,至30d时,基本无存活细胞｡取生长至7~10d的海马神经元进行免疫细胞化学鉴定显示,NSE阳性细胞占绝大多数,阳性部位位于胞浆中,并沿神经突起分布｡NSE阳性细胞胞体呈近圆形,突起丰富､细长,相互交织成网状｡GFAP阳性细胞偶见,阳性部位位于胞浆中,沿细胞突起分布｡GFAP阳性细胞胞体粗大,呈不规则型,扁平,缺乏立体感,细胞突起粗大而短,不相互交织｡表明培养的细胞绝大多数为神经元｡

2.2 HPM辐射后大鼠海马神经元形态变化

假辐射组海马神经元细胞形态较好,呈圆形､三角形,胞体饱满,立体感强,突起丰富,交织成网状｡30mW/cm2 HMP辐射后1h,大鼠海马神经元细胞形态有所改变,部分细胞胞体略萎缩,胞浆减少,突起变细,数目减少,长度变短｡

2.3 HPM辐射后大鼠海马神经元p CaMKⅡ的变化(图 1,2)

免疫细胞化学结果显示,假辐射组海马神经元胞浆中p CaMK Ⅱ呈淡棕黄色弱阳性表达｡30mW/cm2 HMP辐射后1h,大鼠海马神经元胞浆中棕黄色颗粒明显增多,颜色加深,p CaMK Ⅱ表达明显增加｡

注：p-CaMKⅡ于神经元胞浆呈阳性。 图 1 30mW／cm2IMP辐射后1h大鼠海马神经元(sp．X400)

注：胞浆中pcaMKⅡ呈阳性。 图 2 30roW／cm2辐射后1h大鼠海马神经元(LSCM．×1000)

免疫荧光结果显示,假辐射组海马神经元胞浆中p CaMK Ⅱ呈微弱红色荧光,30mW/cm2 HMP辐射后1h,大鼠海马神经元胞浆中红色荧光明显增强,胞核荧光较胞浆弱,同假辐射组相比p CaMK Ⅱ表达明显增加｡表明30mW/cm2 HMP辐射可引起海马神经元CaMK Ⅱ磷酸化增加,其参与HPM辐射致海马突触可塑性的改变｡

3 讨论

CaMK Ⅱ在与记忆形成及LTP相关区域､谷氨酸结合活性区,含量特别高｡被动回避训练可增加N 甲基 D 天冬氨酸受体1型(NR1)的表达和CaMK Ⅱ及磷酸化的CaMK Ⅱ水平[9];CaMK Ⅱ的活性表现主要是通过其自身磷酸化来实现的[10]｡CaMK Ⅱ在NMDA受体介导的信号通路中发挥着重要的作用,其在学习记忆及突触可塑性等生理过程中具有重要的调节作用｡本实验通过观察p CaMK Ⅱ在HPM辐射后海马原代培养神经元细胞中的变化,发现30mW/cm2 HMP辐射后1h,大鼠海马神经元胞浆中p CaMK Ⅱ表达明显增加｡表明CaMK Ⅱ通过其自身磷酸化参与了HPM辐射后NMDA受体信号通路的级联反应事件｡有关CaMK Ⅱ参与突触可塑性变化及NMDA受体信号通路级联反应事件的机制,目前尚未完全阐明｡根据本研究发现结合国内外文献,认为可能与以下因素有关:NMDA受体有CaMK Ⅱ入坞位点,在海马,Ca2+浓度升高通过NMDA型谷氨酸受体内流导致CaMK Ⅱ自身磷酸化激活和突触后聚集,导致LTP,一旦此过程发生,激酶便保持活性,甚至在Ca2+浓度返回基线水平时,激酶也具有活性,参与诸如记忆形成等大脑功能的改变[5, 10]｡故认为CaMK Ⅱ的磷酸化参与HPM导致的海马组织损伤及突触可塑性等变化｡

根据本实验组以往研究HPM可引起氨基酸类神经递质和NMDA受体的改变,结合文献,推测在HPM致突触可塑性变化及学习记忆功能障碍机制中,可能主要是通过谷氨酸及甘氨酸激活NMDA受体,Ca2+内流增加,细胞内Ca2+浓度增加诱导CaMK Ⅱ的磷酸化,进而影响NMDAR介导的级联反应事件的发生过程,导致突触可塑性变化及学习记忆功能障碍｡

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