中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (9): 1084-1085   PDF    
引用本文
张魏巍, 罗炳德, 赵丽瑛. 青蒿琥酯对高温复合内毒素致细胞凋亡保护作用[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(9): 1084-1085.
ZHANG Wei-wei, LUO Bing-de, ZHAO Li-ying Protective effeet of artesunate on cell apoptosis induced by high-temperature endotoximia[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(9): 1084-1085.
青蒿琥酯对高温复合内毒素致细胞凋亡保护作用
张魏巍, 罗炳德, 赵丽瑛     
南方医科大学公共卫生与热带医学学院高温医学研究室, 广州 同和 510515
收稿日期: 2007-12-31
基金项目: 广东省自然科学基金(5004774)
作者简介: 张魏巍(1987- ),女,安徽合肥人,本硕博在读,研究方向:发热的病理生理学。
通讯作者: 罗炳德
摘要： 目的 探讨高温复合内毒素(LPS)作用下,青蒿琥酯(AR)对RAW264.7细胞热休克蛋白70(HSP70)合成及细胞凋亡的影响。 方法 采用体外培养的巨噬细胞系RAW264.7细胞,分为空白对照组、高温复合内毒素组、AR组(又分为4个亚组),于40℃、95%O2、5%CO2条件下共同孵育24h。用RT-PCR技术检测细胞内HSP70mRNA及其蛋白的表达量,用流式细胞术检测细胞凋亡率。 结果 空白组和高温复合内毒素组HSP70m RNA的表达率分别为10%,23%,而AR组可显著提高HSP70mRNA的表达率,为54%,并与高温内毒素组差异有统计学意义(P<0.05)。HSP70蛋白的表达情况与HSP70mRNA一致,而细胞凋亡率的变化则呈相反趋势。 结论 AR进一步诱导高温复合内毒素作用下RAW264.7细胞HSP70m RNA和HSP70蛋白的表达,且可明显降低细胞的凋亡率,可能是其抗损伤保护作用的机制之一。
关键词： 青蒿琥酯     内毒素     热休克蛋白70     细胞凋亡    
Protective effeet of artesunate on cell apoptosis induced by high-temperature endotoximia
ZHANG Wei-wei, LUO Bing-de, ZHAO Li-ying     
Department of Thermal Environment Medicine, Nanfang Medical University, Guangzhou 510515, China
Abstract: Objective To study the effect of artesunate on the production of heat shock protein(HSP70)and the apoptosis of macrophage in RAW264.7 cells induced by high temperature and lipo polysaceharide(LPS)composite factors. Methods Macrophage cell line RAW264.7 in vitro was divided into 4 groups(blank control group,hightemperature and LPS composite group and artesunate(AR)group)and incubated for 24hrs at 40℃ with 95%O2 and 5%CO2.The expression of HSP70 mRNA and protein was detected by RT-PCR,and the rate of cells apoptosis was assessed by flow cytometer(FCM). Results The rate of HSP70 mRNA expression in blank group,high temperature and LPS composite group and AR group was 10%,23% and 54%,respectively,with significant differ ences between high temperature and LPS composite group and AR group(P<0.05).The expression of HSP70 protein showed a coincidence with HSP70 mRNA,in contrast,there was an opposite tendency between the rate of apoptosis cells and the expression of HSP70 mRNA. Conclusion Artesunate could induce HSP70 mRNA and protein expression and obviously reduce the rate of cells apoptosis,and it may be one of the important mechanisms for protective effects against injury.
Key words: artesunate     endotoxemia     heat shock protein(HSP70)     cell apoptosis    

生物细胞在受热和其他损伤、应激因素作用后，合成热休克蛋白。其中，热休克蛋白70(HSP70)生成最为显著，其非特异性的细胞保护作用也很受关注。同时，青蒿琥酯(AR)在高温复合内毒素下对细胞的保护作用[1-3]也有研究。为了解在高温复合内毒素作用下，青蒿琥酯对细胞的保护作用与HSP70对细胞的保护作用，本研究建立高温复合内毒素细胞损伤模型，观察青蒿琥酯对高温复合内毒素作用下细胞HSP70表达的影响，进一步探讨青蒿琥酯的细胞保护作用机制。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

青蒿琥酯(桂林南药股份有限公司，批号：030101)；细菌内毒素(LPS，E.coli Serotype 055：B5,美国Sigma公司)；改良Eagle培养基(DMEM)(美国Gibco公司，Cat.N0.12800-058，LotNo.1324945)；Trizol试剂(上海Invitrogen分公司);Bradford储存液，HSP70多克隆抗体(武汉博士德公司);PCR仪(美国PERKIN ELMER公司);低温高速离心机(美国Bechman公司，MODEL AllegraTM X-22R)；流式细胞仪(美国Coulter公司)；琼脂糖凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司，MODEL 200/2.0)；Doe Gel 2000凝胶扫描成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 细胞

RAW264.7细胞为小鼠来源的巨噬细胞系，用DMEM完全培养基(含10%灭活小牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素，pH 7.1～7.2)传代培养。

1.3 实验方法 1.3.1 细胞分组及处理

细胞用DMEM完全培养基传代培养，实验时用0.25%胰酶消化细胞后收集细胞(台盼蓝染色鉴定细胞活率≥95%)，调整细胞浓度为1×106/ml，接种到24孔培养板，每孔1ml，于95% O2、5%CO2、37℃条件下培养12～18h，待细胞生长至80%融合状杰时。用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，换成无血清的DMEM培养液，按实验要求细胞分为：正常对照组：常规无血清DMEM培养；高温内毒素组：1μg/ml LPS；AR+LPS组：根据AR浓度的不同(20，10，5，2.5μg/ml)分为4个亚组，每个亚组中AR和LPS(1μg/ml)同时加入细胞培养液中。高温内毒素组和AR+LPS组均置于40℃、95%CO2、5%CO2培养箱中培养24h，留取细胞。每实验组4个复孔，所有实验重复3次。

1.3.2 HSP70mRNA表达的测定

Trizol提取细胞总RNA，引物序列：HSP70上游5′-CTGAACCCGCAGAACACCG-3′，下游5′-GAACAGGTCCGAGCACAGC-3′，长度为750bp；β-Actin上游5′-TTACTGCTCTGGCTGGCTCCTA-3′，下游5′-TTGTCAAAGAAAGGGTGT-3′，长度为217bp。PCR反应条件为：50℃ 30min，94℃ 1min，94℃ 30s，48℃30s，72℃ 1min，32个循环，用2%琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，凝胶成像系统观察，拍照，Labwork软件分析测定灰度值，将目的mRNA与β-ActinRT-PCR产物的灰度比值作为目的mRNA的相对表达量(%)。引物均由Primer 5.0软件设计，上海博亚生物技术有限公司合成。

1.3.3 HSP70蛋白表达的测定

用Buffer A细胞裂解液融解各组细胞，并将细胞裂解液分别进行离必沉淀，取其上清用Bradford法测定总蛋白浓度，并用蛋白印迹(Western-blotting)法检测细胞内HSP70表达量变化，用图像分析仪(WEALTEC)扫描，Dolphin 1D软件检测分析。计算各蛋白样品HSP70与对照组HSP70显色积分吸光度比值AHSP70/A对照。

1.3.4 RAW264.7细胞凋亡的测定

用流式细胞术检测细胞凋亡百分率。

1.4 统计分析

采用SPSS 10.0软件进行方差分析。

2 结果 2.1 各组RAW264.7细胞HSP70mRNA表达量(图 1，图 2)

正常的RAW264.7细胞中HSP70mRNA呈低水平表达，在高温复合内毒素下可诱导大量HSP70表达，差异有统计学意义(P<0.01)。应用青蒿琥酯后，可进一步诱导内源性细胞保护蛋白HSP70的产生，随着浓度的增高呈加强趋势；与高温内毒素组比，青蒿琥酯5μg/ml时差异有统计学意义(P<0.05)。10，20μg/ml表达量达高峰，呈平台趋势，二者间差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明，青蒿琥酯本身可以诱导内源性细胞保护蛋白HSP70的增加，继而保护细胞免受应激损伤。

注：M：Mark；1：正常对照组；2：高温内毒素组；3：青蒿琥酯2.5μg/ml组；4：青蒿琥酯5μg/ml组；5：青蒿琥酯10μg/ml组；6:青蒿琥酯20μg/ml组。 图 1 各组RAW264.7细胞HSP70 mRNA表达电泳图

注：与高温内毒素组比较，a P<0.01，b P<0.05，c P<0.01；1：正常对照组；2.高温内毒素组；3：青蒿琥酯2.5μg/ml组；4：青蒿琥酯5μg/ml；组；5：青蒿琥酯10μg/ml组；6：青蒿琥酯20μg/ml组。 图 2 各组RAW264.7细胞HSP70mRNA表达量的变化

2.2 各组RAW264.7细胞HSP70蛋白的表达量

各组细胞内HSP70蛋白条带积分吸光度的变化结果为：正常对照组<高温内毒素组<青蒿琥酯5μg/ml组<青蒿琥酯10，20μg/ml组，且与HSP70 mRNA表达变化趋势相一致。

2.3 各组RAW264.7细胞的凋亡率(表 1)

各组细胞凋亡率的比较：高温内毒素组>青蒿琥酯2.5μg/ml组>青蒿琥酯5μg/ml组>青蒿琥酯10μg/ml组>青蒿琥酯20μg/ml组>正常对照组。

表 1 各组RAW264.7细胞的凋亡率（x±s，n=6）

3 讨论

本实验结果显示，正常细胞组HSP70呈低水平表达，给予高温内毒素复合因素刺激后，细胞内HSP70mRNA和蛋白表达水平均有所增高，以应对有害刺激对细胞的损伤，此结果与有关报道一致[4]。但给予中药青蒿琥酯后，通过对HSP70表达条带的灰度和面积加以分析，细胞内HSP70mRNA和蛋白表达水平显著上升，且随着青蒿琥酯浓度的增加，HSP70的表达持续增加，特别是青蒿琥酯浓度为10和20μg/ml 2组与高温复合内毒素组比较，P<0.01，表明青蒿琥酯能显著上调HSP70的表达量，提高细胞对应激原的耐受性。同时，随着青蒿琥酯浓度的增加，细胞凋亡率呈现明显的下降趋势，并且与高温复合内毒素组比较，P<0.05，表明青蒿琥酯对细胞的保护作用。

实验发现，在青蒿琥酯浓度的变化过程中，随着细胞HSP70表达的增加，细胞凋亡率明显下降。一方面验证了HSP70对细胞的保护作用；另一方面，揭示了青蒿琥酯抗细胞凋亡作用的机制之一是其对HSP70表达的影响。有研究资料显示：HSP70对细胞的保护作用可能与其对NF-KB或iNOS的抑制有关[5-8]。HSP70通过何种途径保护细胞尚待进一步探讨。

参考文献
[1] 张培, 罗炳德, 谭庆, 等. 青蒿琥酯对中暑内毒素血症小鼠腹腔巨噬细胞内游离钙浓度的影响[J]. 中国工业医学杂忐, 2005, 18(2) : 96–98.
[2] 张培, 陈雪梅, 罗炳德, 等. 青蒿琥酯对内毒素信号转道通路中CD14的影响[J]. 中国公共卫生, 2005, 22(3) : 284–285.
[3] 张培, 陈雪梅, 罗炳德, 等. 青蒿琥酯对中暑内毒素血症小鼠腹腔巨噬细胞内CD14和TOLL样受体4的影响[J]. 中华劳动卫生职业病杂志, 2006, 24(4) : 226–228.
[4] 旷劲松, 王雪莲, 张静, 等. HSP70在内毒素休克大鼠胰腺的表达及其意思[J]. 中国医科大学学报, 2004, 33(3) : 219–220.
[5] Malhotra V, Wong HR. Interactions between the heat shock response and the nuclear factor-kappa B signaling pathway[J]. Crit Care Med, 2002, 30(1Suppl) : 89–95.
[6] Kohn G, Wong HR, Bshesh K, et al. Heat shock inhibits tnf-induced I-CAM-1 expression in human endothelial cells via I kappa kinase inhibition[J]. Shock, 2002, 17(2) : 91–97. DOI:10.1097/00024382-200202000-00002
[7] Chela Y, hrrigo AP, CurrieRW, et al. Heat shock treatment suppresses angiotensin II-induced activation of NF-kappa B pathway and heart inflammatory:a role for IKK depletion by heat shock[J]. Am J Physiol Heart Cite Physiol, 2004, 287(3) : 1104–1114. DOI:10.1152/ajpheart.00102.2004
[8] Lau SS, Griffin IM, Mestril R. Protection agains endotoxemia by HSPTO in rodent cardiomyocytes[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2000, 278 : 1439–1445.